Fogorvosi szemle, 2015 (108. évfolyam, 1-4. szám)
2015-03-01 / 1. szám
20 FOGORVOSI SZEMLE ■ 108. évf. 1. sz. 2015. sejtek számának növekedése, különösen a hízósejteké, így hatásukra fokozódik az erek permeábilitása is [26]. Kísérletes DM-vizsgálatok is alátámasztották, hogy a korai streptozotocin DM (StDM) hatására a gyulladásos sejtek és az idegrostok száma megemelkedik [5, 11, 16], míg 14 nappal a kezelés után csökken a gyulladás és a plazma-extravazáció, és degenerált idegrostok jelennek meg a különböző szervekben [27, 28, 31]. Számos vizsgálat foglalkozik a szájüregi képletek vérellátásának változásával DM-ben [20, 30], Ugyanakkor csak nagyon kevés közlemény foglalkozik a nyelv nyálkahártya és nyálmirigyek idegelemeinek és immunsejtjeinek kvantitatív elemzésével. Az előző vizsgálataink megállapították, hogy egyes neuropeptideket (SP, NPY) tartalmazó idegrostok és immunkompetens sejtek mennyisége szignifikánsan megemelkedett DM-ben az ízlelőbimbókban. Arra a kérdésre azonban nem kaptunk egyértelmű választ, hogy ez a változás az összes idegrostra vonatkozik-e. Továbbá nem vizsgáltuk a nyelvben lévő mirigyek beidegzésének változását. Ezért ezen munkánkban a korábban használt primér szérumok mellett peripherin (PER) antitesttel is vizsgáltuk a nyelv nyálkahártya és mirigyek innervációját. A peripherin a perifériás idegrendszerben lévő axonok neurofilamentumainak alegysége [44] és olyan panneurális (összes idegrost) jelző, amely az állati és humán perifériás idegek kimutatására alkalmas [19], Anyag és módszer Az idegelemek vizsgálatára kísérleteinket 30 darab, 120-150 g testsúlyú, hím albínó Wistar patkányon végeztük. Az állatkísérletek megfelelnek a „Revised Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”-nek (ILAR 1996) és a Magyar Állatvédő Törvénynek (1998, Magyarország), valamint a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottsága is engedélyezte ezeket. A diabetes mellitus kiváltásához az állat farki vénájába egyszer 65 mg/testtömeg kg Streptozotocint (Zanosar, Upjohn Company, Kalamazoo Ml 49001, USA) adtunk. A kontroll állatok 0,25 ml fiziológiás só oldatot kaptak. A DM kialakulását a testtömeg csökkenésből, polyureából és glukózureából állapítottuk meg. A farki vénából vett vércukorszint >16 mmol/1 esetén az állatot cukorbetegnek nyilvánítottuk. A kontroll állatok (10 db) ugyanolyan súlyúak voltak, mint a vizsgálat kezdetén a diabeteses csoport. A streptozotocin hatását 2 és 4 hét után vizsgáltuk. 2 (10 db) és 4 (10 db) héttel a kezelés után az állatokat véglegesen elaltattuk és perfundáltuk. Kivettük a nyelvgyököt, majd fagyasztó mikrotómmal metszeteket készítettünk. A kivett mintákat fixáltuk, majd a primer szérummal való inkubálás után avidin-biotin-komplex segítségével peroxidáz reakciót végeztünk. Primer szérumok: a korábban használt SP, VIP, NPY, CGRP, tumor nekrózis faktor a (TNF-a), nukleár faktor kB (NF-kB) mellett az összes idegrost kimutatására egér monoklonális peripherin antitestet is használtunk (5 db) (Novo Castra, katalógus szám: P21935). Az anyagok egy részéből elektronmikroszkópos metszeteket is készítettünk, ahol az idegrostokat és az immunkompetens sejteket analizáltuk, valamint vizsgáltuk azok morfológiai kapcsolatait. A jelzett idegrostok kimutatására avidin-biotin-peroxidáz (Vectastain ABC, Vector Laboratories, Peterborough, UK) technikát (1 órára), valamint diamino-benzidint (DAB Vector, 0,025%, 3,3-diamino-benzidin, 0,0015% H202, 0,05 M Tris-HCI puffer, pH = 7,5) alkalmaztunk 8-10 percre. Nikkellel intenzifikáltunk, majd a végén a metszeteket a zselatinozott tárgylemezekre terítve Depex-szel fedtük le. A hízósejtek vizualizálásához a 0,1%-os toluidinkék festéket (Sigma) vagy hisztaminellenes primer antiszérumot használtunk. A fénymikroszkópos metszeteken megszámoltuk a különböző immunjelzett képleteket, majd statisztikailag értékeltük. Az immunreaktiv (IR) idegrostokat 15- 2000 pm2 szövet területen számoltuk meg és a kapott eredményeket egységnyi területre (100 pm2) vonatkoztattuk. A számoláshoz az egész metszetet vizsgáltuk fénymikroszkóppal 40 szeres nagyításban. Minden egyes vizsgált anyagból kb. 15-25 fényképet készítettünk, majd digitalizáltuk és számítógépes szoftverrel (IMÁN (béta) 2,0 MFA, Budapest, Hungary) analizáltuk. Statisztikai módszer Az eredmények statisztikai értékeléséhez két minta esetén a Student-féle kétmintás t-próbát, több minta összehasonlítása esetén a variancia analízist (ANOVA) használtuk post hoc Bonferroni és páratlan Student-féle kétmintás t-próba összehasonlításokkal. A p < 0,05 esetén az eredményt szignifikánsnak tekintettük. Eredmények Az IR idegrostok a patkány nyelvgyök minden rétegében megtalálhatók különböző mennyiségben. Néhány IR rost a mucinózus és a szerózus mirigyvégkamrák (Weber mirigy) körül is láthatók (1., 2., 3. ábrák). Az IR idegrostok főleg a hámban és a hám alatt találhatók (4., 5., 6. ábrák). Nagyon kevés hízósejt található ezen metszetekben, és hízósejt és IR idegrost kapcsolatot (3 pm-en belül) szintén ritkán tudtuk megfigyelni. Diabetes mellitusban az IR idegrostok mennyisége megváltozott a kontrolihoz képest a nyelvgyökben. Két héttel a diabetes mellitus kialakulása után az IR idegrostok száma szignifikánsan megemelkedett. Nagyon sűrű SP és PER IR idegrost-hálózatot találtunk a papilla vallatae subepithelialis területén és magában a hámban is (5. ábra). Egyes metszetben az IR idegsejtek száma is megemelkedett. A mucinózus mirigyvégkamrák körül is emelkedett az IR idegrostok mennyisége (2. ábra). Azonban négyhetes diabetes esetén minden általunk
