Fogorvosi szemle, 2014 (107. évfolyam, 1-4. szám)

2014-06-01 / 2. szám

44 FOGORVOSI SZEMLE ■ 107. évf. 2. sz. 2014. differenciáltatási és felhasználási iránya az oszteogén irány. Megfelelő farmakológiai indukcióra válaszolva az emberi fogból származó MSC-k valóban differenciáltat­­hatók in vitro körülmények között oszteogén/odontogén irányba. Az ilyen módon kapott sejtek polarizált sejt­testtel rendelkeznek és kalcium-tartalmú mineralizációs csomókat halmoznak fel [11, 15, 16, 18, 26, 27, 29], A humán fogeredetű őssejtekkel végzett kutatásaink folytatásaként most a patkány metszőfogakból izolált sejt­kultúrák vizsgálatával kapcsolatos legújabb eredmé­nyeinkről számolunk be. Kísérleteink elsődleges célja az volt, hogy patkányok alsó metszőfogának pulpa­­szövetéből olyan primer sejttenyészetet hozzunk létre, amely őssejt (vagy progenitor sejt) tulajdonsággal ren­delkező sejteket tartalmaz. Továbbá célul tűztük ki a sejt­kultúrák in vitro differenciáltatását oszteogén és neu­­rogén irányba. Ezenkívül a korábbinál hatékonyabb neurogén differenciációs protokollt kívántunk kifejlesz­teni a tenyésztőedények előzetes felületkezelése révén. Vizsgálati anyag és módszerek Sejtizolálás és sejttenyésztés Hím Wistar patkányok (120-180 g) mandibulájának el­távolítása után a mandibula bázisát feltárva nyertük ki a pulpaszövetet az alsó metszőfogakból, majd azonnal steril PBS-be (Gibco) helyeztük. Az őssejtek izolálását a kutatócsoportunk által humán őssejtek esetében ko­rábban publikált módszer [15, 16, 27] kisebb módosítá­sával végeztük. A pulpaszövetet óraüvegen steril körül­mények között szikével felaprítottuk, majd a kollagenáz I enzim (Sigma) 1 mg/ml-es koncentrációjú oldatában emésztettük 1 órán át 37° C-on, és közben 10 percen­ként vortexeltünk. Az emésztett szövetdarabokat 250 g­­vel 5 percig centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és a sejteket tápoldattal a tenyésztőedénybe mostuk. 100 U/ml penicillint és 100 pg/ml streptomycint (Sigma), valamint 2 mM L-glutamint (Sigma) tartalmazó aMEM (Gibco) tápoldatban tenyésztettük az izolált sejteket 10%-os FBS (fetal bovine serum, Gibco) koncentráció mellett. Hetente kétszer cseréltük a tápoldatot, és he­tente egyszer passzáltuk a tenyészeteket 0,05% trip­­szin-EDTA (Gibco) oldat segítségével. A sejteket stan­dard körülmények között 37 °C hőmérsékleten, 5%-os C02-tartalmú levegőn tenyésztettük. Sejtproiiferáció vizsgálata WST-1 teszttel A sejtproiiferáció vizsgálatát egy korábban leírt proto­koll [16] alapján végeztük, csak a hagyományos MTT- teszt helyett a nagyobb érzékenységű WST-1 tesztet alkalmaztuk. A 96 lyukú szövettenyésztő tálka üregeibe kiültetett sejtekről másnap a tenyésztő médiumot eltá­vol ítottuk, helyette szérummentes tápoldatot adtunk a sejtekhez a tenyészetek szinkronizálása céljából. A szérummentes tápoldatot 24 óra elteltével különböző szérumtartalmúra cseréltük, majd újabb 24 óra eltelté­vel vizsgáltuk a sejtek életképességét a vízoldékony tetrazóliumsót tartalmazó WST-1 (4-[3-(4-iodofenil)-2- (4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene diszulfonát) reagens (Roche) segítségével. A 2 órás inkubációt kö­vetően a minták abszorbanciáját 450 nm hullámhosz­­szon mértük le, 655 nm referencia hullámhossz mellett. Oszteogén irányú differenciáltatás Az oszteogén irányú differenciálódást az irodalomban már leírt módon váltottuk ki [15-17]. Az indukciós mé­dium a tenyésztő tápoldathoz hasonlóan 100 U/ml pe­nicillint és 100 pg/ml streptomycint, valamint 2 mM L-glu­tamint tartalmazott, viszont csak 1% szérumot (FBS). Emellett az pMEM médium még 10~8 M dexametazon­­nal, 50 pg/ml L-aszkorbinsav-2-foszfáttal és 10 mM ß-gli­­cerofoszfáttal is ki lett egészítve. Ebben az oszteogén médiumban tenyésztettük a sejteket 3 héten át passzá­­lás nélkül, miközben hetente kétszer tápcserét végez­tünk. A 3. hét végén a kalcium-vegyületek lerakódását kimutató Kóssa festéssel (a nemzetközi irodalomban von Kossá festésként ismert a magyar kutató által kifej­lesztett módszer) [19], valamint alizarinvörös festéssel azonosítottuk a mineralizációs gócokat. Neurogén irányú differenciáltatás A már korábban publikált háromlépéses protokollunk felhasználásával indukáltuk a sejtek neurogén diffe­renciálódását [18], A DPSC-k kiültetéséhez használt DMEM/F12 (Gibco) tápoldatot 2,5% FBS-sel (Gibco), 100 U/ml penicillinnel és 100 mg/ml streptomycinnel (Sigma) egészítettük ki. A kiültetést követő napon a fenti médiumot lecseréltük 2,5% FBS-t, 10 ng/ml bFGF-et (Sigma) és 10 pM 5-azacitidint (Sigma) tartalmazó DMEM/F12 tápoldatra, amiben a differenciádé első lépé­seként 48 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. PBS-sel történő mosást követően a második, vagyis indukciós fázisban 72 órán át DMEM/F12 médiumban tenyésztet­tük a sejteket 250 pM IBMX (Sigma), 50 pM Forskolin (Sigma), 1 mM db cAMP, 0,2 pM TPA (Sigma), 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml NGF (Sigma), 1 mM dbcAMP (Sigma), 30 ng/ml NT-3 (Sigma) és 1% ITS (Sigma) hozzáadásá­val. Az érési fázisban 3-10 napig 1 mM dbcAMP, 1% N2, 1% B27, és 30 ng/ml NT-3 tartalmú Neurobasal A mé­diumban tartottuk a sejteket. Neurogén differenciációs protokoll módosítása Az intenzívebb proliferáció elősegítésére a tenyésztő táp­oldatba az izolálástól fogva 10 ng/ml bFGF-et is tettünk. A neurogén differenciáltatás második fázisából kihagytuk a dbcAMP-t, továbbá a harmadik (érési) fázist kettébon­tottuk az Arthur és munkatársai áItal publikált protokoll [2] szerint. Az érés első hetében a DMEM/F12 médium az antibiotikumok mellett 1% ITS-t és 40 ng/ml bFGF-et tar­talmazott, míg a második héten ezt még 50 nM retinsawal is kiegészítettük. A tápoldatot hetente kétszer cseréltük. Felületkezelés Mivel az irodalomban a neurogén differenciáltatás so­rán számos különféle felületen tenyésztik a sejteket,

Next

/
Oldalképek
Tartalom