Fogorvosi szemle, 2009 (102. évfolyam, 1-6. szám)
2009-10-01 / 5. szám
FOGORVOSI SZEMLE 102. évf. 5. sz. 2009. 177 Immuncitokémiai vizsgálatok a STRO-1 kimutatására A sejteket üveglemezen tenyésztettük (5x104 sejt üveglemezenként), 4% paraformaldehiddel fixáltuk 20 percen keresztül, szobahőmérsékleten. Az aspecifikus kötődést foszfátpufferes fiziológiás sóoldatban (PBS) oldott 7,5% fötális borjusavóval (FCS) blokkoltuk (90 perc szobahőmérsékleten). A sejteket egér IgM anti- STRO-1 elsődleges antitesttel (1:10, R&D Systems) inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. A megfelelő jelerősítés érdekében ezt követően biotinilált kecske anti-egér IgM (1:1000, Molecular Probes) szekunder antitestekkel inkubáltunk 1 óráig szobahőmérsékleten, majd újabb 1 óráig fluorszecens Alexa 488 festék és avidin komplexével (1:500, Molecular Probes). A mintákat konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk (Olympus). A festési kontroll esetében elsődleges antitestet nem alkalmaztunk. A sejtproliferáció vizsgálata MTT-teszt alkalmazásával A 96 üregű szövettenyésztő tálca egy-egy üregébe 0,1 ml tenyésztő médiumban kb. 2-3000 sejtet ültettünk ki, majd a tálcát 24 órára 37 °C-os, 5% C02-dal dúsított 100% páratartalmú levegőt biztosító tenyésztőszekrénybe helyeztük. A sejtek kitapadását követően a tápfolyadékot eltávolítottuk, majd egyszeri foszfátpufferes (PBS, Invitrogen, Carlsbad, California) mosást követően 24 órára üregenként 0,1 ml szérummentes a-MEM tápoldatot mértünk be a sejtciklusok szinkronizálása | céljából. Ezt követően eltávolítottuk a szérummentes tápot, majd a kísérleti protokollnak megfelelően hozzáadtuk az adott kísérletnek megfelelő kezelőanyagot, protokollban meghatározott időtartamra. Ezután ismét 1x PBS-sel öblítettük a sejteket, majd 100-100 pl 0,2 mg/ml koncentrációjú szérummentes MTT (1 -(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan, Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri) oldatot mértünk az üregekbe. A formazán kristályok kialakulásával járó színreakciót követően az MTT oldatot pipettával eltávolítottuk, és a sejtek mitokondriumaiban NADH által redukált lila formazánkristályokat 100-100 pl DMSO (dimetil-szulfoxid, Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) oldatban oldottuk fel, majd szuszpendálást követően az egyes minták abszorbanciáját 570 nm-es hullámhosszon mértük le. Oszteogén differenciálódás kiváltása Az oszteogén indukciót az irodalomban már leírt módon végeztük [28,29]. A DPSC sejteket 1% FCS-t (fetal calf serum), 100 U/ml penicillint, 100 pg/ml streptomycint, 2 mM L-glutamint, 10‘8 M dexametazont, 50 pg/ml L-aszkorbinsav 2-foszfátot, 10 mmol/L ß-glicerofoszfátot tartalmazó aMEM médiumban tenyésztettük passzálás nélkül. A tápfolyadékot hetente kétszer cseréltük. A kalciumakkumulációt az Alizarin-vörös festéssel (pH 4.2, ammonium hidroxid pufferrel) vizsgáltuk 20 nap elteltével. A szérum, az EGF és a BMP2 hatásának vizsgálata EGF hatását vizsgáltuk a szokásos tenyésztőközegnek megfelelően kiegészített a-MEM médiumban oldva 0,0001 pg/ml, 0,001 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml illetve 10 pg/ml koncentrációkban, 0%, 2,5% és 10% szérum (FCS) alkalmazása mellett. A sejteket a szinkronizációt követően 1 napig kezeltük. Az eredményeket a szérummentes illetve az adott szérumkoncentrációjú EGF-mentes közeghez hasonlítottuk. A BMP2 növekedésre gyakorolt hatását a szokásos tenyésztőközegnek megfelelően kiegészített a-MEM médiumban oldva vizsgáltuk szérummentesen és 10% szérumtartalom mellett a következő koncentrációkban: 0,0005 ng/ml, 0,005 ng/ml, 0,05 ng/ml, 0,5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 pg/ml. A sejteket a szinkronizációt követően 1 napig kezeltük. Az eredményeket a szérummentes, illetve az adott szérumkoncentrációjú BMP2-mentes közeghez hasonlítottuk. Statisztikai analízis Az eredményeink statisztikai kiértékelését egyszempontos varianciaanalízist követően Tukey-Kramer teszttel végeztük. A diagramok oszlopain a párhuzamos mérési eredmények átlagát és az átlag hibáját (±SEM) tüntettük fel. Eredmények Sejtizolálás és primer kultúra létrehozása Régóta ismert, hogy oszteogén irányba differenciálható őssejtek izolálhatok csontvelőből plasztik felületre kiültetve, pusztán a felülethez történő tapadásuk révén és megfelelő stimuláció hatására ezek a sejtek prolife-1. ábra. DPSC-kultúrák morfológiája (fáziskontraszt mikroszkópos felvétel, 100x nagyítás). A: a sejtek szuszpenzióban enzimatikus emésztést követően. B: A sejtek letapadás után fibroblaszt morfológiájúak. C: 3 nap elteltével szubkonfluens tenyészet jön létre. D: Konfluens tenyészet a kiültetést követő 5. napon.
