Horváth László (szerk.): Halbiológia és haltenyésztés (Mezőgazda Kiadó, Budapest, 2000)
1. Biológiai alapismeretek - 1.4 Orbán László: Molekuláris eljárások alkalmazása a haltenyésztésben
A RAPD eljárásnak három nagy előnye van: i. alkalmazásához nem kell ismerni a vizsgálandó genomot; ii. az eljárás minden fajon működik, ha egyszer beállították, többé nem kell optimalizálni (29.C ábra); iii. a primerek kereskedelemben elfogadható áron kaphatók, így az eljárás egyike a legolcsóbb molekuláris genotipizálási módszereknek. A RAPD markerek öröklése ugyan követi a mendeli öröklődés szabályait, de az esetek túlnyomó többségében nem az erre a célra optimális kodomináns, hanem dom- ináns-recesszív öröklésmenetet mutatnak: egy adott csík jelenléte (+) domináns annak hiányával (-) szemben. A domináns homozigóta (egy adott markert mindkét kromoszómán tartalmazó; +/+) egyedeket azonban a RAPD eljárással nem lehet het- erozigóta (+/-) társaiktól a csíkok intenzitása alapján elkülöníteni. így egy adott populáció RAPD analízisével a közöttük levő különbségek egy része nem mutatható ki, ehhez a (+) egyedeket az adott markerre nézve (-/-) társaikkal kell keresztezni kell és utódaik genotípusát vizsgálva a két csoport egymástól elkülöníthető, ez azonban komoly időveszteséget jelenthet. A RAPD reakció további hátrányai: nagyon érzékeny a reakciókörülmények állandóságára, így ugyanazon mintacsoporton több labor által párhuzamosan végzett vizsgálatok eredményeit összevetni nehéz; a csíkok eredete és egymáshoz való viszonya nem ismert, ezért a kapott mintázatok kiértékelése esetenként igen bonyolult feladatot jelent; egy csíkban a genom különböző régióiból származó, de azonos méretű fragmentek keveréke is előfordulhat, mely a marker azonosítását és klónozását megnehezítheti. AFLP Az AFLP21 eljárás a legújabb a DNS markerek molekuláris analízisére szolgáló módszerek közül. A genomot először két különböző restrikciós enzimmel feldarabolják, majd az így keletkezett fragmentek végére speciális „adaptor” szakaszokat „ragasztanak” (ligálás), amikre könnyen lehet sokszorosítás kiindulásaként használható prímért tervezni. Az így előkészített genomról ún. horgonyzott primerekkel végzünk PCR-rel sokszorozási. Ezeknek a primereknek az a jellegzetessége, hogy lefedik az adaptert, de nem érnek véget a restrikciós hasítóhely végénél, hanem 1-2-3 bázis hosszúságban belenyúlnak az ismeretlen genomdarabba. A kilógó szakasz megléte miatt az adapterokat tartalmazó fragmenteknek csak arról a hányadáról történik sokszorozás, amelynél az első (második és harmadik) bázisához a primer megfelelő bázisa párosodni képes (30. ábra). A horgony(ok) bázisösszetételének változtatásával más és más genomrégiókban lehet markereket keresni. A PCR reakcióval felsokszorozott fragmenteket általában denaturáló poliakrilamid gélen (szekvenáló gél) választják el és rádioaktív jelöléssel vagy ezüstfestéssel detektálják. A ez egy primerpárral kapott mintázat több információt szolgáltat, mint ami egy RAPD primerrel nyerhető, ugyanakkor a módszer beállítása és napi használata, valamint az eredmények kiértékelése jóval időigényesebb. 21 Az Amplified Fragment Length Polymorphism kifejezés rövidítése. 157
