Szemészet, 2003 (140. évfolyam, 1-4. szám)
2003-06-01 / 2. szám
140. évfolyam (2003) 69 HPLC-mérés A minták aminosav-összetételének analízise nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálattal történt. A feltáró pufferrel (1. korábban) 1 mg/ml fehérjetartalomra beállított mintákból 200 pl-t csavaros műanyag csőbe mértünk, hozzáadtunk 4 pl 400 mM-os dezferrioxamint és 40 pl 500 mM-os butilált hidroxitoluént (BHT). hogy megakadályozzuk a hidrolízis folyamán bekövetkező esetleges szabadgyök-képződést. Majd az elegyhez 200 pl 12 N sósavat mérve 120 °C-on, egy éjszakán át hidrolizáltunk. Ezt követően a hidrolizátumot 0,2 pm pórusú fecskendőszűrővel szűrtük. A szűrletből 20 pl-t fecskendeztünk a HPLC-készülék (Shimadzu LC-10 aVP) Rheodyne manuális injektorába. Az aminosavak mennyiségi meghatározását Lichrospher-C18 silica (5 pm) oszlopon (Merck), autofluoreszcenciájuk alapján végeztük (tirozinok: excitáció 275 nm, emisszió 305 nm; fenilalanin: excitáció 258 nm, emisszió 288 nm). A futtatás izokratikus feltételek mellett, vagyis állandó összetételű eluens oldattal történt. Eluáló oldatunk 1% ecetsavat, 1% Na-acetátot, 98% desztillált vizet tartalmazott. Az egyes vizsgált aminosavak esetében meghatároztuk a görbe alatti területet, melyet a fenilalanin görbéje alatti területre vonatkoztattunk. Eredmények Vizsgálataink során a műtéttel eltávolított lencseminták minden esetben 60 év feletti betegektől származtak. Az 1. táblázatban foglaltuk össze betegeink kor és nem szerinti megoszlását, különös tekintettel a diabeteses anyagcserezavar meglétére, illetve hiányára. Az eltávolított cataractás szemlencsék érettségének (matur/progrediens) megítélése a műtéti beavatkozás előtt, tágított szembogár mellett, réslámpás vizsgálattal történt. Betegeink között a nők nagyobb arányban (14/8) szerepeltek. A kontrollként kapott cadaver-lencseminták szintén 60 évnél idősebb donoroktól (4 férfi, 3 nő) származtak. Mind a kontroll-, mind a betegmintákból megfelelő feltárást követően összfehérje-meghatározást végeztünk. A kontrollminták esetében (intakt lencse) a fehérjetartalmat nedvessúlyra is megadtuk. A lencsefehérjékből a szolúbilis fehérjéket kinyerve meghatároztuk ezek részarányát a összfehérje-tartalomhoz viszonyítva, melyet százalékban fejeztünk ki. A 2. táblázatban foglaltuk össze adatainkat, mely az egyes vizsgálati csoportok átlagértékeit tartalmazza a szórással. Szembetűnő a műtéti beteganyagból származó lencseminták szolúbilis frakciójának alacsonyabb részaránya a kontrolllencsékéhez képest (p<0,001). A cataractás minták betegcsoportjai között a különbségek nem szignifikánsak (p<0.1). Összehasonlító elektroforetikus vizsgálatokkal a lencsefehérjéket mintánként, molekulasúlyuk szerint szeparáltuk. Azonos fehérjemennyiségeket hasonlítottunk össze. Ily módon a fehérje-összetételbeli azonosságok és különbségek jól megítélhetőek voltak. A fehérjefrakciók megoszlását mind a teljes homogenizátumból (összfehérje), mind a szolúbilis frakcióból analizáltuk. A lencsefehérjék között a 20-30 kDa közötti tartományban vándorló fehérjecsoport jelenléte karakterisztikus volt valamennyi mintánál. Denzitometriás 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. ábra. Lencsehomogenizátumok és szolúbilis fehérjék SDS poliakrilamid gél elektroforetogramja. 12,5%-os gél, Coomassie Brilliant Blue festés ezüstös intenzifikálással. Kontroll (1., 2.), diabeteses cataracta (3-6.), nem-diabeteses, matur cataracta (7-8.), összhomogenizátum (1., 3., 5., 7.), szolúbilis frakció (2., 4., 6., 8.), M: molekulasúly-marker Szemlencsefehérjék elektroforetikus és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás vizsgálata
