Szemészet, 1991 (128. évfolyam, 1-4. szám)
1991-12-01 / 4. szám
Szemészet, 128 (1991) 145-146 A Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Egyetem Szemészeti Klinikájának (igazgató: dr. Süveges Ildikó egyetemi tanár) közleménye In vitro foszforilációs vizsgálatok normál és kataraktás humán lencsékből preparált membránokon Facskó Andrea ETT pályázati támogatásával készült kísérletek alapján. A szerző megvizsgálta a normál és kataraktás humán lencsékből preparált membránfrakció foszforilálhatóságát cAMP- és Ca2+, foszfolipid-függő kinázok felhasználásával. Eredményei szerint a membránfrakcióban két foszfoprotein volt izolálható, melyek molekulasúlyuk alapján az MP26 és MP18 fehérjéknek feleltek meg. Normál lencsékben az MP26 fehérjébe történt foszfátbeépülés szignifikánsan meghaladta a kataraktás lencsékben mért értékeket. Az MP26 fehérje degradációs termékei (21-22 kDa polipeptidek) nem voltak foszforilálhatóak egyik proteinkináz enzimmel sem. Az eredmények alapján valószínűsíthető, hogy a humán lencsékben az MP26 életkorfüggő degradációja együtt jár a fehérje foszforilációs helyének elvesztésével. Kódszavak: fehérje foszforiláció, membránfrakció, MP26, MP18 Phosphorylation of human lens membrane proteins by various protein kinases in normal and cataractous lenses. The cAMP-dependent and protein kinase C mediated phosphorylation was examined in normal and cataractous human lens membranes. The incubation of the membranes with [y—32P] ATP under phosphorylating conditions revealed the presence of two phosphoproteins (MP26 and MP18). When the 32P—incorporation into the MP26 was calculated, higher values were found for the normal lens as compared to cataracts. The degradation products of the MP26 protein (21-22 kDa proteins) were not found to be phosphorylated by the various kinases. These results suggest that the age-dependent degradation of the MP26 in human lens is associated with the loss of phosphorylation sites. Keywords: protein phosphorylation, membrane fraction, MP26, MP18 Bevezetés A humán lencse fő tömegét a lencse epithelből differenciálódott lencserostok adják, melyek rétegesen egymásra rakódnak, így a lencsemagban a legidősebb, legkorábban differenciálódott rostok helyezkednek el, míg a lencsekéreg a fiatalabb rostokat tartalmazza. Az érett lencserostok, tekintettel igen speciális funkciójukra, erősen differenciálódtak, elvesztették szubcelluláris organellumaikat és speciális csak a lencsére jellemző fehérjék (krisztallinok) jelentek meg a citoplazmában. A lencserostokat határoló meambrán is főleg a lencsére specifikus membránfehérjéket tartalmaz. A humán lencsére jellemző két legfontosabb membránfehérje az MP26 és az MP18 (1-3, 5), melyek nevüket molekulasúlyukról kapták (26, illetve 18 kDa). Ez a két polipeptid alkotja a lencserost membrán fehérjetartalmának mintegy 67-70%-át. Különböző emlősökből származó lencsék esetében igazolni lehetett, hogy az MP26 és MP18 in vitro foszforilálható mind a cAMP-függő proteinkinázzal (4,7), mind a Ca2+, foszfolipid-függő proteinkinázzal (proteinkináz C) (10, 11). Továbbá, in vivo körülmények között, amikor lencsefragmentumokat inkubáltak 32P-ortofoszfát és cAMP vagy aktív forbolészterek jelenlétében szintén igazolható volt az MP26 foszforilációja (8,11). Ugyanakkor humán lencsék esetében lényegesen kevesebb adat áll rendelkezésre a membrán foszforilációs folyamatairól. Ezért célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk normál és kataraktás humán lencsékből származó membránpreparátumok esetében a különböző proteinkinázok hatását a fehérje foszforilációra. Anyag és módszer A lencséket a Szegedi Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Egyetem Szemészeti Klinikáján gyűjtöttük kataraktaműtét-, illetve bulbus enucleatiót követően. A cukorbetegek és az előzőleg steroid terápiában részesült betegek kataraktás lencséjét nem használtuk fel a kísérletekhez. Az egyes lencséket a lencsetok eltávolítását követően NaHC03 pufferben homogenizáltuk. A membránfrakció izolálása Goodenough szerint történt (6). A fehérjetartalmat Peterson módszerével mértük (12). Az in vitro foszforilációs vizsgálatokhoz általában 100 /tg membránfehérjét használtunk és a foszforilációt 30 °C-on végeztük 5 percig. A proteinkináz C enzimmel történt foszforiláció esetében a kísérleteket 30 mM-os Tris/HCl puffer jelenlétében végeztük (pH: 7.0), ami 5 mM MgCL-t, 0.5 mM EGTA-t, 10 mM dithiothreitolt (DTT), 10 mM NaF-t, 0.1 mM [y-32P]ATP oldatot (1500 cpm/pmol) és tisztított proteinkináz C-enzimet (10 /tg fehérje/ml) tartalmazott. A proteinkináz C-enzimet humán thrombocytákból tisztítottuk (13). Az izolált preparátum igen magas specifikus aktivitással rendelkezett (135000 U/perc/ mg enzim; egy egység az az aktivitás, ami 1 pmol [32P]ortofoszfát bevitelét katalizálta a szubsztrátba), melyet lizingazdag hisztonnal mértünk 30 °C-on. A thrombocytákból izolált proteinkináz C-enzim abszolút kalciumfüggőnek bizonyult és 0.5 mM EGTA jelenlétében csak minimális bazális aktivitást mutatott. A fenti oldatkeverékben mért általában igen alacsony foszfátbeépülést bazális foszforilációnak tekintettük. Ehhez a keverékhez bizonyos mintákban még CaCl2 oldatot (1 /xM szabad Ca2+ koncentráció beállításához), illetve a CaCl2 mellett még foszfatidilszerint (10 /xg/minta) és aktív fórból észtert (PMA, 4 /xM) is adtunk. A szabad Ca2+ koncentráció (pCa 6.0) beállítása komputerprogramm segítségével történt. A proteinkináz C által médiáit foszforilációnak a Ca2+ jelenlétében és a Ca2+, foszfatidilszerin, valamint PMA jelenlétében mért foszfát inkorporációk közötti különbséget tekintettük. A cAMP-dependens proteinkináz katalitikus alegységgel (Sigma Co., St Louis, USA) végzett in vitro foszforilációt 50 mM-os foszfát puffer (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1 mM [y—32P]ATP és 35 egység katalitikus alegység jelenlétében végeztük. Az in vitro foszforilációkat követően a reakciót elektroforézis mintapufferrel (62.5 mM Tris/ HC1 pH 6.8, 2% sodium-dodecilszulfát (SDS), 10% glicerin, 5% /8-merkaptoetanol és nyomokban bromfenolkék) állítottuk le. Az SDS poliakrilamid gélelektroforézist Laemmli szerint (9)
