Szemészet, 1985 (122. évfolyam, 1-4. szám)
1985 / 1. szám
Kísérleteink gerincét az üvegtesti collagén mennyiségét és összetételét reprezentáló hidroxiprolin szint meghatározások képezték. Ehhez, a rendelkezésünkre álló anyagot a következőképpen preparáltuk. A mélyhűtött szemek fokozatos melegítése közben a burkokat és a retinát négy szektorra vágva emeltük le, a még fagyott üvegtestről. Az üvegtestet teljes megolvadása után homogenizáltuk, majd 4 °C-on 40 000 g-vel 30 percig centrifugáltuk. Az első centrifugálással nyert felülúszóból (természetesen is oldott collagénfrakció) 1 ml mintát vettünk és hidrolizálás után Stegemann és Stalder [23] módszere szerint megmértük a hidroxiprolin tartalmát. Az üledékből elkülönítettük a sóban és a savban oldódó, valamint az inszolubilis frakciókat. Az egyes frakciók extrahálása 4 °C-on 3 X24 órán keresztül, 4 cm-es amplitúdójú, 80/min frekvenciájú horizontális rázás közben történt. Az extrakciók során a mintákat 40 000 g-vel 30 percig naponként centrifugáltuk és a felülúszót polietilén csövekbe gyűjtöttük. Egy-egy üvegtest összegyűjtött felülúszójában hidrolizálás után határoztuk meg a hidroxiprolin tartalmat. A sóban oldódó collagén frakciót előzőleg desztillált vízben kétszer átmosott üvegtest üledékéből extraháltuk. Három egymást követő extrahálást végeztünk 0,02M Tris- HC1 pufferrel (pH 7,4), amely 0,5 M NaCl-t tartalmazott. Az összegyűjtött felülúszókat azonos mennyiségű 12 M HCl-el hidrolizáltuk. Vakuum lepárlás és vízben való újra oldás után mértük a hidroxiprolin tartalmat. A savban oldódó frakciót a sóban nem oldódó maradékból 0,5 M ecetsav segítségével (pH 3,4) vontuk ki az előzőekben részletezett módszerrel. Végül a sós és savas extrakció után még megmaradt nem oldódó frakció collagén tartalmát mértük meg. A természetesen is oldott állapotú hidroxiprolin az üvegtest felülúszójában csak súly/térfogat arányban volt kifejezhető, mivel a burkaitól megtisztított üvegtest menynyisége jelentős egyedi eltéréseket mutatott. A további mérésekkel viszont egy-egy szem üvegtestéből az oldódó és nem oldódó hidroxiprolin összmennyiségét határoztuk meg. Alapvetően a kísérlet jellege, de a vizsgálati anyagok méretbeli ingadozásai sem tették lehetővé, hogy a collagénfrakciók súlyváltozását közvetlenül hasonlítsuk össze. Kézenfekvő volt, hogy az egyes frakciók arányát minden kísérleti állat esetében az összhidroxiprolin százalékában adjuk meg. így az egyedi különbségekből adódó torzítást kizárva, egy-egy frakció százalékos arányét variancia analízissel már össze tudtuk hasonlítani a kezelt, illetve kontrollcsoportokban. A variancia analízisben a százalékos értékek logaritmus transzformált] ával dolgoztunk. Eredmények A természetesen is oldott collagénfrakció //g/'tnl változása a traumatizált (B), a traumatizált, intravitrealisan és intravénásán DPA-val kezelt (C) csoportban egymáshoz és az egészséges üvegtestben mért mennyiségekhez viszonyítva (A) az alábbiak szerint alakult. Az 1 ml üvegtesti felülúszóban mért hidroxiprolin mennyisége a traumatizált állatcsoportban az egészséges szemekhez viszonyítva megkétszereződött. Ez az eltérés 5%-os szinten szignifikáns (t(14> = 2,2690). Ezzel szemben a szemek művi perforációját követő hidroxiprolin szint növekedést a DPA megakadályozta, xtSE pg/ml (n=8) (n=8) (n=14) 7. ábra. Nyulak üvegtesti felülúszóiban mért, természetesen is oldott állapotú collagénszint alakulása a kezelt és kontrollcsoportokban 12
