203971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3'-azido-3'-dezoxitimidint és egy további hatóanyagot tartalmazó szinergetikus kombinációs gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 971 A 2 Négy külön vizsgálatot végeztünk, különböző donorokból származó PBMC alkalmazásával. Eredményeinket a IV. táblázatban mutatjuk be. Az első kísérletben mindkét gyógyszert azután adagoltuk, miután a sejteket a vírusnak kitettük. 40xl06 sejtet tartalmazó alikvot részt 105 TCID50 vímst tartalmazó 20 ml tápközegben szuszpendáltunk, majd egy óra múlva vírusmentes tápközeggel háromszor mostuk, majd a vírusmentes tápközegben újraszuszpendáltuk. A 2-4. kísérletekben a sejteket rekombináns a-interferonnal (rlFNaA) vagy anélkül 24 órán át inkubáltuk, majd AZT-t adtunk hozzá, és vírusnak tettük ki. A vírust közvetlenül adtuk kis térfogatú tápközegben a tenyészethez, és nem mostuk ki. A vírus oltóanyagok a 2., 3. és a 4. kísérletben 4X103,103, illetve 2xl03 TCID50 értékűek. Az alkalmazott gyógyszerek koncentrációját a tápközeg cseréjénél mindig úgy állítjuk utána, hogy az eredeti koncentrációt tartsuk fenn. A meghatározott koncentrációjú rlFNaA és AZT kombinációknak valamennyi kísérletben vizsgáltuk a kétszeres hígításait párhuzamos vizsgálatokban. Valamennyi, a kombinációkban alkalmazott rlFNaA és AZT dózist önmagában is megvizsgáltuk, hogy referencia eredményeket kapjunk. Minden kísérletben, valamennyi koncentrációban, a fertőzött és a nem fertőzött kontrollokhoz 2 tenyészetet használtunk. Az 1. kísérletben 3,2 umól/1 AZT-t és 128 E/ml rIFNaA-t alkalmaztunk, valamint e kombináció kétszeres hígítását vizsgáltuk 5 párhuzamos vizsgálatban. A 2. és 3. kísérletben 0,16umól/1 AZT-t és 128 E/ml rIFNaA-t alkalmaztunk, valamint e kombináció kétszeres hígítását vizsgáltuk 3-4 párhuzamos vizsgálatban. A 4. kísérletben 0,08 ,umól/1 AZT-t és 128 E/ml rIFNaA-t alkalmaztunk, valamint e kombináció kétszeres hígítását alkalmaztuk 2 párhuzamos vizsgálatban. Körülbelül egy hét eltelte után a tenyészetekben 3-4 naponként vizsgáljuk a vírus jelenlétét. A sejtekben a HÍV antigéneket indirekt immunfluoreszcens eljárással vizsgáltuk; a felülúszó reverz transzkriptáz (RT) aktivitását és vírus-hozamát vizsgáljuk és radioimmun vizsgálattal (RíA, radioimmunassay) meghatározzuk HÍV p24 antigén tartalmát. Chou és Talalay [Advances in Enzyme Regulation, 22, 27-55 (1984)] többszörös gyógyszerhatást elemző eljárását alkalmazzuk a kombinált gyógyszerhatás számítására. Az adatokat a gyógyszer-kölcsönhatások megállapítására szolgáló geometriai módszerrel, az izobologram eljárással értékeltük ki. A kívánt hatást (például 50%os gátlást) biztosító koncentrációt a vízszintes tengelyen, az azonos hatást adó rlFNaA koncentrációt a függőleges tengelyen ábrázoljuk. Meghúzzuk az ezeket a pontokat összekötő egyenest és feltüntetjük a kombinációban alkalmazott szereknek azt a koncentrációját, amely azonos hatást fejt ki. Ha ez a pont az előbbi egyenes alá esik, a kombinációt szinergikus hatásúnak tekintjük. Az 1. kísérletben valamennyi alkalmazott AZT koncentráció gátló hatású volt, lehetetlenné téve a kombináció hatásának megítélését. A 2-4. kísérletekben következetesen jelentkezett a két szer szinergikus kölcsönhatása. (Lásd a IV-IX. táblázatokban). A szinergizrnus az alkalmazott víms replikáció minden mértékénél jelentkezett, és még akkor is megmaradt, amikor önmagában elhanyagolhatóan kis hatású rIFNaA-t alkalmaztunk. A szinergia-számításokat a 2-4. kísérletek RT adatainak, az 1. és 3. kísérlet vírushozam adatainak és a 4. kísérlet RIA adatainak többszörös gyógyszerhatás elemzésével végeztük. Az izobologram eljárás eredménye is szinergizmust mutat. IV. táblázat A vizsgálat száma Hív oltóanyag módszer Hozzáadott HÍV (TCIDjo) A gyógyszeradagolás ideje rlFNaA AZT 1. A 105 0 0 2. B 4xl03-24 óra 0 3. B 103-24 óra 0 4. B 2X103-24 óra 0 >. a) „A" módszer 40xl06 sejtet szuszpendálunk IQ* TCIDjo HIV-t tartalmazó 20 ml tápközegben, 1, órán át 37 °C-on tartjuk, majd mossuk és újá" szuszpendáljuk, „.. „B” módszer A megjelölt mennyiségű vímst táp| közegben lévő 2xl06 sejthez adjuk, a sejteket ezt követően nem mossuk. rw V. táblázat 2. kísérlet, 10. nap rlFNaA és AZT hatása az átlagos RT értékekre (cpm/106 sejtxlO3) rlFNaA (E/ml) AZT (limól/1 0 8 16 32 64 128 0 205 173 150 193 169 151 0,01 159 85 0,02 110 42 0,04 71 10 0,08 31 3 0,16 7 1 VI. táblázat 3. kísérlet, 13. nap rlFNaA és AZT hatása az átlagos RT értékekre (cpm/106 sejtxlO3) rlFNaA (E/ml) AZT (Umól/1) 0 16 32 64 128 0 157 143 117 117 130 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
