203970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hatóanyagként 3-szubsztituált-2-oxidol-1-karboxamid-származékokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 970 B 2 zetlen rIL-la jelenlétében mért radioaktivitást tekintjük (cpm). Hill-féle kalibrációs görbét készítünk a log(Y/l00-Y)-t log C-vel szemben ábrázolva, ahol Y a kontroll 125J-rIL-lß kötődés %-át és C a jelzetlen rlL- la koncentrációját jelenti. A legkisebb négyzetek elve alapján a 20-80% Y-értékek közé regressziós egyenest illesztünk. Ezután a fentiek szerint nyert feliilúszók IL-1 szintjeinek megállapítása céljából a fenti eljárásban hígított felülúszókkal helyettesítjük az rIL-la-t és a mért %-os kötődési értékek felhasználásával meghatározzuk az IL-1 koncentrációt a standard Hill-diagramból. Minden hígításból párhuzamos próbákat végzünk és általában csak a 20-80% közötti Y értékeket használjuk az átlagos IL-1 szintek kiszámításához. A továbbiakban a fentiek szerint kezelt letapadt makrofágok sejten belüli IL-1 a tartalmát a szakember által jól ismert és az alábbiakban leírt Westem-levonat módszerrel („Western blot analysis") vizsgáljuk. A kezelt, letapadt makrofágokat kikaparjuk a lemez mélyedéseiből. Minden kezelt csoport sejtjeit háromszor mossuk konyhasótartalmú foszfát pufFerrel (PBS), majd a sejteket 10 mM diizopropil-fluor-foszfátot (DFP) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) tartalmazó foszfát pufferben (50 mM KC1, 10 mM NaCl, 50 mM KH2P04, 1,0 mM EDTA, pH 7,5) oldott 0,5% NP-40 segítségével emésztjük. Az éppen maradt magokat leülepítjük és a felülúszókat kisméretű tiszta centrifugacsövekbe töltjük. Minden felülúszóból 15 ul-t (amely körülbelül 2xl05 sejttel egyenértékű) Laemmli szerinti minta-pufferben oldunk [Laemmli U. K„ Nature (London) 227, 680-685 (1970)], gradiens (10-20%) poliakrilamid-nátrium-dodecil-szulfát (PAG-SDS) gélre visszük fel és az elektroforézist 3-4 órán át folytatjuk állandó 35 mA áramerősséget alkalmazva. Ezután a fehérjéket a gélről éjszakán át nitrocellulóz (NC) papírra (Micron Separations, Inc., Westboro, Massachusetts) visszük át 220 mA áramerősséget, valamint 192 mM glicint, 25 mM Triszt, 0,1% SDS-t és 25% metanolt tartalmazó puffert alkalmazva. Az NC papírra változatlan formában átvitt két másolatra olyan 1/250 hígítást! antiszérumot rétegzünk, amelyet kecskében indukáltunk egyrészt Escherichia co/r'-ban létrehozott egér rIL-la-val és anti-egér rIL-lß-val [rekombináns IL-1 a (rIL-la), amelynek aminosavszekvenciája megfelel az IL-la-ra leközölt, 115-270 közötti szakasz aminosavsorrendjének (Lomedico P. M. és munkatársai, Nature 312,458-462 (1984)], másrészt E. co/r'-ban létrehozott rekombináns IL-lß-val (rIL-lß) [melynek aminosavszekvenciája megfelel az IL-lß-ra megadott, 118-269 aminosavszakasz aminosavsorrendjének (Grey P. W. és munkatársai, J. Immunoi. 137, 3644-3648 (1986)]. Miután a levonatokat PBS pufferben oldott 0,5% Tween 20-szal mostuk, a másolatokat kecske IgG-vel (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) szemben előállított sertésszérummal konjugált 1/1000 hígítású torma-peroxidázzal teszteljük és precipitáló 4-klór-l-naftol szubsztráttal előhívjuk. A sávok letapogatására LKB lézer denzitométert (2220 modell, LKB, Paramus, New Jersey) használunk. A pásztázás adatainak mennyiségi értékeléséhez AT+T PC 6300 számítógépbe betáplált LKB GelScan XL Evaluation softwaret alkalmazunk. Amikor a fent leírt makrofágokat a találmány szerinti vegyülettel - ahol X klóratomot, Y hidrogénatomot és R 2-tienilcsoportot jelent - kezeljük 3,3% fötális botjúszémm jelenlétében, a vegyület nem gátolja a lipoxigenázt, minthogy nem következik be a leukotrién (LTC4) képződés gátlása az LTC4[3H]RIA készlettel (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) végzett „radioimmunoassay” során, az IL-1 képződése azonban gátlódik. A radioimmunassay-t polipropilén csövekben hatjuk végre, és az összes reagenst 0,1% zselatint, 0,01 M EDTA-t és 0,1% NaN3-ot tartalmazó 10 millimólos foszfátpufferrel (pH 7,4) hígítjuk. 50 pl felülúszóhoz pufferben oldott 4000 cpm radioaktív jelzőanyagot és hígított antiszérumot adunk, és éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. A nem kötődött radioaktív jelzőanyagot 0,5% Norit A szén és 0,5% dextrán T-70 szuszpenziójával (250 pl) távolítjuk el. Centrifugálás után a felülúszó 250 pl-éhez 1,0 ml Atomlight-et (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) adunk és a radioaktivitást 1,5 ml polipropilén mikrocsövekben Beckman LS-250 folyadékszcintillációs spektrométer segítségével leméijük. A minták radioaktivitását stgfidard log-logit görbéből extrapoláció útján határozzuÜSmeg (a standardokat a mintákkal együtt vizsgáljuk). A fenti vizsgálat során az (I) általános képleSff vegyületek az alább eredményeket adták: X Y R IL-lgÉÜás (%/ Cl H 2-tienil 60 F Cl 2-tienil Ü*.4BI 59 F Cl benzil 39 " % az IL-1 gátlás két mérés átlaga. A vegyület koncentrációja 10 pM. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás hatóanyagként (I) általános képletű vegyületek vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóit - ahol X hidrogén-, klór- vagy fluoratomot, Y hidrogén- vagy klóratomot és R benzil- vagy tienilcsoportot jelent - tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot emlősök interleukin-1 bioszintézisének gátlására alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyületeket vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóit emlősök interleukin-1 közvetítette csontanyagcsere-zavarainak kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
