203964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kötődés indukálására alkalmas gyógyszerkészítmény és hatóanyaga előállítására
1 HU 203 964 B 2 fehérje-frakciót tartalmazó készítménnyel. Ezután a fogat megfelelően elhelyezzük a befogadó szájüregében, rögzítjük és megvárjuk, amíg a készítmény hatására regenerálódó cementum létrehozza a természetes kapcsolódást a fog és az állcsont között A találmány szerinti készítmény egy előnyős kiviteli alakja esetében az aktív fehérje-frakciót szövetragasztó készítménnyel kombináljuk. A szövetragasztók önmagukban olyan gyógyászati készítmények, amelyek fibrinogént, XHI. faktort (a vérplazma egyik alvadási faktorát) és trombint tartalmaznak, az utóbbit a felhasználás előtt keverjük a készítményhez. A találmány szerinti készítmény tehát a zománchártya-kivonat mellett fibrinogént és XHI. faktort - adott esetben tartósítószerként aprotinint - és elkülönítve trombint tartalmaz, amelyeket a felhasználás előtt összekeverünk és így helyezzük a műtéti területre. Egy ilyen készítmény elkészítéséhez jó alapul szolgál az IMMUNO AG (Bécs, Ausztria) Ttsseel kereskedelmi nevű szövetragasztója, amibe az aktív fehérje-frakció egyszerűen belekeverhető. A szövetragasztóval kiegészített találmány szerinti készítmény előnyei a periodontitis sebészi kezelésében tűnnek ki, ahol a fog szilárd rögzítése mellett a vérzés csillapítása és a varrásmentes sebzárás is megoldható vele. A találmány szerinti készítmény előnyös hordozóanyagai cellulóz- és alginátszármazékok, például karboxi-metil-celiulóz, nátrium- vagy propilénglikol-alginát lehetnek. A találmány tárgyát a továbbiakban példákban mutatjuk be, amelyek majmokon és embereken végzett fogászati kísérleteket tárgyalnak. A példákban fogunk hivatkozni a mellékelt ábrára, amely a zománchártyából kivont fehérjék SDS-poliakrilamid gélelektroforetikus elválasztásának eredményét mutatja be. A két fő fehérje-frakció közül az alacsony molekulatömegűek gyűjtőneve amelogeninek, a magas molekulatömegűeké enamelinek. 1 1. példa Kivonat készítése állati fogakból Annak eldöntésére, hogy a zománchártya melyik alkotórésze aktív, különböző kivonatokat készítettünk sertés-zománchártyából és azok hatását állatkísérletekben vizsgáltuk. E-l: 0,3 g zománchártyát (fehérjetartalma 27±4%) elpépesítünk 3 ml fiziológiás (0,9%-os) nátrium-klorid oldatban, majd jégfürdőben hűtve ultrahanggal (Polythrone-készülék) homogenizáljuk 10 másodperces intervallumokban egy percen át A homogenizátumot liofilizálva 199 mg szövetport kapunk, aminek fehérjetartalma Lowry szerint mérve 47±2%. H-2: 0,3 g zománchártyát a fenti módon homogenizálunk, majd 4 percen át vízfürdőben melegítjük. A liofilizálással kapott 199 mg szövetpor oldható fehérjetartalma 13±3%. E-3: 0,3 g zománchártyát elpépesítünk 3 ml 0,5 mólos ecetsavoldatban, a fenti módon homogenizáljuk, majd 24 órán át keverjük 4 °C hőmérsékleten a fehérjék jobb kioldódása érdekében. Ezután a homogenízátumot lecentrifugáljuk, az üledéket felvesszük és lefagyasztjuk, a felülúszót pedig liofilizáljuk. A liofilizátum tömege 68 mg, fehérjetartalma 29±3%. E-4: 0,3 g zománchártyát 3 ml 0,03 mólos Tris-pufferben (pH = 7,4, 10% EDTA) elhomogenizálunk, majd a homogenizátumot 24 órán át hidegen keverjük, centrifugáljuk, a felülúszót desztillált vízzel szemben dializáljuk és liofilizáljuk. A kapott anyag tömege 11 mg, fehérjetartalma 33±2%. E-5: az E-4 preparátum üledékét tízszeres térfogatú, 0,5 mólos ecetsav-oldatban felvesszük és hidegen keverjük 24 órán át, majd újra centrifugáljuk és a felülúszót liofilizáljuk: 109 mg anyagot kapunk, aminek fehérjetartalma 15±3%. E-6: az E-5 preparátum üledékét liofilizálva 37 mg anyagot kapunk, aminek fehérjetartalma 18±4%. E-7: 0,3 g zománchártyát 3 ml 0,03 mólos Tris-pufferben (pH = 7,4, 10% EDTA) elhomogenizálunk 0,4 mmól fenil-metil-szulfonil-fluorid (egy proteáz-inhibitor) jelenlétében, majd a továbbiakban úgy járunk el, mint az E-4 készítmény esetében. Az eredmény 11 mg anyag, aminek fehérjetartalma 41±2%. E-8: az E-7 preparátum centrifugálás utáni üledékét 0,5 mólos ecetsav-oldattal extraháljuk 48 órán át, majd újra centrifugáljuk és a felülúszót liofilizáljuk: 101 mg anyagot kapunk, aminek fehérjetartalma 17±1%. E-9: az E-8 preparátum üledékét liofilizáljuk; a kapott anyag tömege 40 mg, fehérjetartalma 3Q±3%. Az E-l - E-9 készítményeket a megadott fehérjetartalom mellett a fehérjék molekulatömeg szerinti megoszlásával (SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel mérve), a fehérjék izoelektromos pontjaival és a preparátumok szénhidrát-tartalmával jellemeztük. A sertés-zománchártya fehérjéinek molekulatömeg szerinti megoszlását láthatjuk a mellékelt ábrán. Az elektroforetogramot LKB Ultroscan készülékkel értékeltük ki, a molekulatömegeket a Pharmacia gyártotta kalibrációs készletekkel (14-90 kd között a fehérje-, 2-14 kd között a polipeptid-készlettel) történő összehasonlítással becsültük meg. Az ábrán az E-4 és E-5 extraktumok elektroforetogramjai láthatók, az 1. táblázatban pedig hat extraktum fehérjéinek molekulatömeg szerinti megoszlását mutatjuk be. Az E-l-E-9 jelzésű zománchártya-extraktumok biológiai aktivitását foggyökereken mesterségesen létrehozott felületi sérüléseken vizsgáltuk. Majmok foggyökereit feltárva a gyökér külső felszínén, a fognyaktól a gyökércsúcs felé haladva, 5 mm hosszúságú sebzést ejtettünk fogászati fúróval úgy, hogy a csonthártyát, a cementumot és a csontos fogmeder széli részét is eltávolítottuk. A kísérleti készítményeket a csontsebbe helyezve a lágyrészek sebét megfelelően elláttuk és gyógyulni hagytuk; a kontroll esetében a csontsebet nem kezeltük semmilyen anyaggal. (Táblázat a következő oldalon) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
