203933. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapot regenerálására sejttenyészetből
1 HU 203 933 B 2 indol-3-piroszőlősavat, indol-3-ecetsavat és p-klór-fenoxi-ecetsavat Az előnyös auxin az a-naftil-ecetsav. Az auxinoknak bármely olyan koncentrációját alkalmazhatjuk a jelen találmány szerinti eljárásban, amely kallusz-képzést indukálhat. A megfelelő koncentráció 0,1 és 10 mg/liter között van. Előnyös koncentráció a 2 mg/liter, főleg ha az auxin a-naftil-ecetsav. A kallusz indukciós tápközegben levő citokinin bármilyen citokinin lehet, amely képes kallusz indukálására. A megfelelő citokininek között találjuk a kinetint, 6-benzil-adenint, 2-izopentil-adenint és zeatint Az előnyös citokinin a kinetin. A citokinin bármely koncentrációját, amely képes kallusz-képződést indukálni, alkalmazhatjuk a jelen találmány szerinti módszerhez. A rregfelelő koncentráció 0,1 és 10 mg/liter között van. Előnyös koncentráció 1 mg/liter, különösen amikor a citokinin kinetin. Ha a tápközcg szilárd, ez olyan alkotórészt tartalmaz, amely megszilárdulást okoz, pl. 0,8% agart, pl. Agar Noble (Difco) agart, vagy 0,8% agarózt (minden százalék ebben a leírásban tömeg szerint van megadva). A szövetet kallusz indukciós tápközegen tenyésztjük annyi ideig, amely elegendő a kallusz keletkezéséhez, így pl. szövetet lehet tenyészteni olyan kallusz indukciós tápközegen, amely szénfonásként glükózt tartalmaz. Öt hét indukciós periódus a tipikus. Allenyésztéseket hajtunk végre, ha szükséges, hogy megakadályozzuk a bámulást Előnyösek az egyhetes altenyésztések. A keletkező kallusz lehet szervetlen, vagy tartalmazhat pro-embrionális sejttömeget embriogén kalluszt és/vagy embriókat. Normális esetben, amikor hipokotilokat vagy szikleveleket alkalmazunk az explantálum fonásaként, a kallusz szervezetlennek tűnik. Amikor szomatikus embriókat alkalmazunk explantátum-forrásként a kallusz legalább egy része, úgy tűnik, embriogén kalluszból áll, amelyet halványsárga szín és csomósodás jellemez. A kallusz fényképe, amelyet az (a) lépés szerint szomatikus embriókból és sziklevelekből kapunk, az 1. illetve 2. ábrákban látható. Az így létrejött kalluszt azután előnyösen át lehet vinni olyan kallusz altenyésztő tápközegbe, amely hasonló a kallusz indukciós tápközeghez, azzal a kivétellel, hogy ez szénforrásként szacharózt tartalmaz, az allenyésztést akár 5 hónap időtartamon át folytatva. Előnyös, ha az altenyészetbe egy vagy két hónap múlva friss tápkőzeget juttatunk havonta, előnyösen szacharóz-tartalmú kallusz indukciós tápközeget. A kalluszt lehet sötétben is indukálni, de az indukciót előnyösen világosban végezzük. A fény lehet pl. 0,5-150 p Em~2S~l intenzitású (-41,75-12525 lux). (b) lépés. Pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai Az (a) lépésből kapott kalluszt olyan folyékony tápközegben szuszpendáljuk, amely elősegíti a pro-embrionális vagy burjánzó embrionális sejttömeg kifejlődését. Fontos, hogy a sejtsűrűség alacsony legyen. Ennek megfelelően 40 mg kallusz/ml tenyésztő tápközegnél kevesebbet, előnyösen 15 mg kallusz/ml tenyésztő tápközegnél kevesebbet, még előnyösebben 5 mg kallusz/ml tenyésztő tápközegnél kevesebbet szuszpendálunk. A (b) lépésben alkalmazható tápközeg bármilyen tápközeg lehet, amely képes pro-embrionális sejttömeget indukálni. A tápközeg szervetlen sókat, vitaminokat, valamilyen szénforrást és valamilyen auxint tartalmaz. A tápközeg tartalmazhat még szerves nitrogénforrásokat, citokinineket, aminosavakatés más adalékokat is, pl. kazein-hidrolizátumot vagy kókusz-vizet. A szervetlen sók és vitaminok lehetnek ugyanazok, mint a fenti (a) lépésben. Előnyösek az MS szervetlen sók és a B-5 vitaminok. A szénforrás lehet ugyanaz, mint a fenti (a) lépésben. Előnyös a szacharóz alkalmazása. A szénforrás koncentrációja 0,1-100 g/liter. Mintegy 20 g/liter az előnyös, különösen ha a szénforrás szacharóz. Az auxint azok közül az auxinok közül lehet kiválasztani, amelyeket az (a) lépésben alkalmazunk. Az előnyös auxinok a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav és a picloram. A legelőnyösebb a 4-amiuo-3,6,6-triklór-pikolinsav, továbbiakban picloram. Az auxin koncentrációja a (b) lépésben alacsony. A pontos koncentráció függ az adott, alkalmazott auxintól. A viszonylag kis auxinkoncentráció általában hasonló ahhoz, amelyet szuszpenziós tenyésztő tápközegben alkalmaznak, és jelentősen kisebb, mint a (c) lépésben alkalmazott megfelelő auxinkoncentráció. Amikor a picloram az alkalmazott auxin a (b) lépésben, a koncentráció 0,01-5 mg/liter, előnyösen 0,1- 1 mg/liter és legelőnyösebben 0,5 mg/liter. Amikor 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav az alkalmazott auxin a (b) lépésben, a koncentráció 0,01-0,5 mg/liter, előnyösen 0,05-0,25 mg/liter, legelőnyösebben mintegy 0,1 mg/liter. A pro-embrionális sejttömeg indukcióját előnyösen levegőztetett tápközegben hajtjuk végre 20 °C és 35 °C, előnyösen 22 °C és 33 °C, legelőnyösebben 25 °C és 31 °C közti hőmérsékleten. A levegőztetést bármely olyan eljárással lehet végezni, amely a szakterületen ismert, pl. rúzatással. A (b) lépés végrehajtható sötétben is, de fénynél is legföljebb 75 p Enr2S_1-nél (= 6262,5 lux), előnyösen 5 és 10 p Ern^S'1 között (■» 417,5-835 lux). A kalluszt a tápközegben előuyösen altenyésztés nélkül tartjuk fenn, amíg a pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai képződnek és elkezdődik a gyors burjánzás. A gyors burjánzás beindulása általában 3 és 8 hét között, tipikusabban 5 és 7 közölt tart. Az indukciós periódus során a tápközeget helyettesíthetjük friss tápközeggel, bár előnyös, ha nem zavarjuk a tápközeget ebben a periódusban. A pro-embrionális sejttömeg átváltozása kalluszból csomós aggregátummá nyilvánvaló azok számára, akik a növényi szöveltenyésztés szakterületén jártasak. Ez a pro-embrionális sejttömeg halványsárga színével és csomós természetével különböztethető meg. Az ilyen sejttömeg fényképe a 3. ábrában látható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
