203933. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapot regenerálására sejttenyészetből
1 HU 203 933 B 2 A jelen találmány gyapot növények reagálására szolgáló eljárásra irányul tenyésztett sejtekből szomatikus embriogenezis segítségével. Az eljárás hatékonyabb, mint a szakterületen eddig leírt eljárások. A szomatikus embriogenezist meg kell különböztetnünk egy másik regenerálási eljárástól, amely organogenezisként ismeretes. Mindkét eljárásban az olyan fonásokból, mint pl. gyökerek, levelek vagy szárak, kapott explantátumokat tenyésztjük. Új, differenciált szövetek képződnek vagy közvetlenül az explantátumból, vagy az explantátnmból kifejlődő nem differenciált kallusz szövetből. Az oiganogenezisben az új differenciált szövetek gyökerek és/vagy hajtások. A szomatikus embriogenezisben viszont az új differenciált szövetek bipoláris szerkezetek, amelyek összekapcsolt gyökér- és hajtás merisztémás gócokat, vagyis embriókat tartalmaznak. Különböző stádiumok ismerhetők fel az embrió fejlődése során. Ezek a stádiumok magukban foglalják az alábbi, a szakterületen ismert globuláris, szív, torpedó és érett stádiumokat Megfelelő körülmények között az embriók csíráznak és csíranövényekké fejlődnek, amelyek viszont teljes növényekké fejlődnek. A szomatikus embriókat nagy mennyiségben lehet termelni és ezért alkalmasak tömeges szaporításra és klónozásra. Bizonyos esetekben úgy találjuk, hogy a szomatikus embriogenezissel termelt teljes növények sejtjei genetikailag különböznek azoktól a sejtektől, amelyeket az embriogén kallusz előállításához alkalmaztunk. Az ilyen úton módosított növényi sejtekről azt mondják, hogy a szomaklonális változásként ismert genetikai változáson mentek keresztül. Bizonyos esetekben az új genotípus kedvező változásokat alakit ki. A módosított genotípus bevezetése növényi sejttenyészet segítségével a szomatikus embriogenezis egy másik alkalmazását jelenti. A szomatikus embriogenezist lehet alkalmazni tenyésztett sejtekből olyan növények regenerálására, amelyek egy adott vonásra vannak szelektálva. így pl. a tenyészeteket ki lehet tenni valamely frtotoxin hatásának, amelyre toleranciát kívánunk elérni. A szomatikus embriogenezist lehet azután alkalmazni az olyan növények regenerálására a sejtekből, amelyek a leginkább képesek tolerálni a fitotoxint. Az ilyen módon végzett, tenyésztett sejteket és szöveteket alkalmazó in vitro szelekciót Chaleff és munkatársai írják le [Science, 223,1148-1151 (1984)]. Olvashatók a szakterületen beszámolók gyapot növények regenerálásáról szövetekből szomatikus embriogenezis segítségével. így pl. Rangan és munkatársai [In Vitro, 20, 256 (1984)]. beszámolnak a gyapot (G. birsutum) sikeres regenerálásáról szomatikus embriogenezissel [35th Annual Meeting of the Tissue Culture Association, Houston (1984)]. Davidonis és munkatársai [Plant Science Letters, 32, 89 (1983)] néhány növényt állítottak elő G. hirsutum szomatikus pro-embrioidjaiból, amelyet kétéves kallusz szövetekből kaptak. Finer és munkatársai [TCA Report, 17, 8 (1983)] növényt regeneráltak G. klotzschianum szomatikus embrióiból. Smith és munkatársai [In Vitro, 13, 329 (1977)] egy csíránövényt regeneráltak G. arboreumból származó sziklevél kalluszából. A technika állásában ismertetett módszerekben az embriókat szilárd tápközegeken alakítják ki, és ezek hiányosak annyiban, hogy nem alkotnak növényeket olyan nagy számban, amely a nagyüzemi alkalmazáshoz szükséges lenne. Az a képesség, hogy növényeket regenerálunk tenyésztett sejtekből, csak akkor bír gyakorlati jelentőséggel, ha a növény-kezdemény (propagula) képződése, valamint a növények regenerálása a propagulából elég hatékony. Ennek megfelelően hatékonyabb módszerekre van szükség a gyapot növények regenerálására szomatikus embriogenezissel. A jelen találmány tárgyai közé tartoznak azok a technika állásából ismert eljárásoknál hatékonyabb eljárások, amelyek tenyésztett gyapotsejtekből szomatikus embriókat állítanak elő, és az ilyen embriókból növényeket regenerálnak. A jelen találmány további tárgyai eljárások szomatikus embriogenezisbez, sejtszuszpenziós tenyésztő rendszert alkalmazva. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt. A jelen találmány fent ismertetett és további tárgyait úgy hajtjuk végre, hogy eljárást nyújtunk pro-embrionális gyapotsejttömeg előállítására folyékony szuszpenzióban; az eljárás az alábbi lépésekből áll: (a) gyapot kallusz képződés redukálása gyapot növény szövet ráhelyezésével megfelelő kallusz indukciós tápközegre 20-40 °C hőmérséklet között, megfelelő altenyészettel, hogy megakadályozzuk a bámulást; (b) a kallusz felszuszpendálása 40 mg/l-re megfelelő folyékony pro-embrionális sejttömeg indukáló tápközegben, amely viszonylag kis koncentrációban legalább egy auxint tartalmaz, egészen addig, amíg a pro-embrionális sejttömegek csomós aggregátumai keletkeznek és elkezdenek gyorsan butjánzani; és (c) a pro-embrionális sejttömegek gyorsan burjánzó, csomós aggregátumainak átvitele olyan folyékony tápközegbe, amely képes kisebb, finomabban diszpergált pro-embrionális sejtmasszákat termelni, ahol az említett tápközeg viszonylag nagy koncentrációban legalább egy auxint tartalmaz. A pro-embrionális sejttömegek képesek regenerálódni érett embriókká, satjnövényekké, és teljes növényekké. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat. Az 1-8. ábrák a jelen találmány különböző stádiumait mutatják be. Az 1. ábra az alábbi (a) lépésben leírt módszerrel előállított kallusz fényképe, forrásként szomatikus embriókat alkalmazva. A fénykép 6,2- szeres nagyítású. Az 1,2 cm-es vonalszakasz 2 mm-t képvisel. A 2. ábra az alábbi (a) lépésben leírt módszerrel előállított kallusz fényképe, forrásként szikleveleket alkalmazva. A fénykép 22,7-szeres nagyítású. Az 1,2 cm-es vonalszakasz 0,5 mmt képvisel. A 3. ábra a (b) lépésben leírt eljárással előállított proembrionális sejttömegek csomós aggregátu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
