203906. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a merszacidin nevű új antibiotikum és sói és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 906 B 2 A találmány tárgya eljárás a merszacidin nevű új antibiotikum előállítására, valamint eljárás hatóanyagként ezt az új antibiotikumot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A merszacidint a német törzsgyűjteményben DSM 4584 számon letétbe helyezett eubaktérium Bacillus Y-85,54728 törzs (letétbe helyezés napja: 1988. 05. 06.), valamint annak mutánsai vagy variánsai fermentálásával állítjuk elő. A merszacidin egy ciklikus polipeptid, amely az (I) képlettel jellemezhető. A királis szénatomok konfigurációja a (II) képleten látható. A találmány szerinti eljárás nemcsak a merszacidin, hanem annak gyógyászatiig elfogadható sói előállítására is vonatkozik. A merszacidin különféle kémiai ekvivalensei is előállíthatók szakember számára ismert módon. A ciklusos peptid-antibiotikumokat a CRC Handbook of Antibiotics (antibiotikum-kézikönyv) IV. kötetében a 263-424. oldalon a Ciklusos peptidek c. fejezetben ismertetik. A Bacillus nemzetségből izolált antibiotikumokat az „Antibiotics, origin, nature and properties” (Antibiotikumok, származásuk, jellemzésük és tulajdonságaik) c. könyvben (szerkesztő Korzybski T. és munkatársai, 1978, ül. kötet, 1529-2078. oldal) is ismertetik. Az egyéb mikroorganizmusokból származó polipeptid-antibiotikumokat ugyanezen az irodalmi helyen ismertetik, az 1. kötet 311-491. oldalán. A rendelkezésünkre álló adatok alapján azonban a merszacidin a fenti irodalmi helyeken ismertetett öszszes ciklikus polipeptid-antibiotikumtól egyértelműen különbözik. A Chemical Abstracts egyetlen olyan vegyületet sem ismertetett, amelynek móltömege és aminosav-ősszetétele a merszacitidinéval megegyezne. A merszacitidin előállítására használt eubaktériumot - amelyet a Hoechst India Limited törzstenyészetében Y-85,54728 számon tartunk nyilván - egy sóbepárlóból nyert talajmintából (Maharashtra, India) izoláltuk, és Bacillus-fajtaként azonosítottuk. A merszacidin gyógyászatilag elfogadható sóit ismert módon állíthatjuk elő, különféle vegyületekkel, például szerves aminokkal, így trietil-aminnal vagy tri(2-hidroxi-etil)-aminnal, alkálifémekkel és alkáliföldfémekkel, így nátriummal, káliummal, magnéziummal és kalciummal; szervetlen savakkal, így sósavval, kénsavval vagy foszforsavval és szerves savakkal, így ecetsavval, citromsavval, benzoesavval, maleinsavval, fumársavval, borkősavval vagy p-toluolszulfonsavval. A találmány tárgya tehát eljárás egy új antibiotikum, a merszacidin előállítására, a Hoechst India Limited törzsgyűjteményében Y-85,54728 számon nyilvántartott törzs, valamint annak mutánsai és variánsai tenyészésével. Az eljárás során az Y-85,54728 törzset, annak mutánsait és/vagy variánsait aerob körülmények között tenyésztjük, szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben, majd a tenyészléből a fenti antibiotikumot izoláljuk és tisztítjuk. Szénforrásként például galaktózt, glicerint, szacharózt, vagy glükózt használhatunk. A galaktóz előnyös szénforrást jelent. Nitrogénforrásként előnyösen élesztőkivonatot, marhahúskivonatot, kukoricalekvárt, kazein-hidrolizátumot, vagy szervetlen anyagokat, például ammóniumsókat használhatunk. Nitrogénforrásként különösen előnyös a kukoricalekvár. A szervetlen tápsók közül példaként a nátrium-hidrogén-foszfátot, kálium-hidrogén-foszfátot, kalcium-kloridot és magnézium-szulfátot említhetjük. A nyomelemek például vas-, mangán-, réz-, vagy cinksók vagy más fémsók lehetnek. Az Y-85,54728 törzset előnyösen 26 és 29 °C közötti hőmérséklet-tartományban tenyésztjük, 6,5 és 7,2 közötti pH-értéken. Az Y-85,54728 törzset különösen előnyösen 28 °C (±1 °C) hőmérsékleten, pH 7,2 értéken tenyésztjük. A tenyésztés ideje előnyösen 60-72 óra, ezalatt képződik a találmány szerinti eljárással előállított merszacidin optimális hozammal. A tenyésztést különösen előnyösen 66 órán keresztül folytatjuk, rázólombikos merített tenyészetben vagy laboratóriumi fermentorban. Kívánt esetben a fermentorban habzásgátló szert - például Desmophen®-t (poliol, gyártó cég a Bayer AG, Leverkusen, NSZK) - használhatunk. A tenyésztés lefutását, és a kívánt merszacidin képződését a tenyészlé Staphylococcus aureus 35 209 P, Staphylococcus aureus R 85 és Alcaligenes faecalis elleni biológiai aktivitásával métjük, agardiffúziós módszer segítségével (lásd pl. Oxoid-Handbuch 1972, 2. kiadás, kiadó: Oxoid Limited, London, England). A kapott tenyészlében a merszacidin csak a tenyészet szűrletében található, ami a sejttömegtől centrifugálással választható el. A tenyészet szűrletéből a merszacidint ismert eljárásokkal, például polimer adszorpciós anyagokon, így Diaion® HP-20-on (Mitsubishi Chemical Industries, Japán), vagy Amberlite® XAD- 2(R), XAD-7(R)-en (polisztirol mátrixból, akril-észterből vagy amin-oxidból álló polimer adszorbens, átlagos pórusátmérője (40-225)* 10-10 m, Rohm and Haas Company, USA) végzett hidrofil kromatográfiás eljárással, vagy vízzel nem elegyedő oldószerekkel - például etil-acetáttal vagy butanollal - végzett extrahálással izoláljuk. Előnyösen úgy járunk el, hogy a merszacidint Diaion HP-20-on adszorbeáljuk, majd megfelelő oldószerekkel - például metanollal, acetonitrillel vagy ezek vizes elegyeivel - eluáljuk. A merszacidin eluálására oldószerként előnyösen metanolt használunk. Az aktív eluátumokból az oldószer, így a metanol eltávolítása után nyers merszacidint kapunk. A további tisztítást például szilikagélen, módosított szilikagélen, cellulózon vagy Sephadex® LH-20-on (lipofil gélszűrő anyag, gyártja a Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) végzett kromatografálással érhetjük el. Előnyösen szilikagélen kromatografálva tisztítjuk a nyers merszacidint, az eluálást acetonitril és víz elegyével végezzük, úgy, hogy a víz koncentrációját lépcsőzetesen 5-10%-kal növeljük. A biológiai vizsgálat szerint aktív eluátumot koncentrálva kapjuk a félig tiszta kívánt terméket. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
