203905. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ketonvegyületek mikrobiológiai enantioszelektív redukálására
1 HU 203 905 B 2 ciókörülményekkel. Egy hasonló szintézist, amelynél 4-amino-3-oxo-6-metil-hepténsav-etil-észtert alkalmaznak, Steulmann és Klostermeyer írt le (lásd a fenti irodalmi hivatkozást). Ha R3 jelentése nem hidrogénatom, az lehasítható aminovédőcsoport. A találmány szerinti mikroorganizmusokkal végzett ketosztatin redukciónál, eltérően a klasszikus redukciós eljárásoktól, aminovédőcsoport jelenléte nem szükséges. Bizonyos feldolgozási eljárásoknál a redukció végén, különösen akkor, ha a reakcióterméket a szerves fázisba kell átvinni, a védőcsoportjelenléte viszont igen hasznos, mivel a nem védett termék általában vízben oldható. Ha a redukciót aminovédőcsoportot tartalmazó ketosztatinnal végezzük, az aminovédőcsoport nem tartalmazhat mikroorganimusokkal redukálható ketocsoportot. Az aminovédőcsoportot a ketosztatinra ismert eljárásokkal visszük fel és aminovédőcsoportként előnyösen, terc-butil-oxi-karbonil- (BOC) vagy benzil-oxikarbonil- (Z) csoportot alkalmazunk. A találmány szerinti eljárással alkalmazott redukálóélesztők azért előnyöseké mivel ezek egyrészt igen nagy dehidrogenáz aktivitással rendelkeznek, másrészt könnyen hozzáférhetők és egyszerűen tenyészthetők. Az élesztők közül a következő nemzetséghez tartozókat alkalmazzuk: Saccharomyces és Hansenula. Különösen előnyös a Hansenula satumus, Hansenula anomala és Hansenula ciferrii fajok alkalmazása. Az előnyös élesztők kereskedelmi forgalomban kaphatók vagy az erre a célra felhatalmazott helyeken beszerezhetők (pl. Hansenula ciferrii: DSM 70 780; Hansenula satumus: DSM 70 278; Saccharomyces uvarum DSM 70 547 vagy Hansenula anomala: DSM 70 130). A mikroorganizmusok tenyésztését és a sejtmassza előállítását ismert eljárások szerint végezzük. A találmány szerinti eljárásnál előnyösen alkalmazható élesztőket például a következő összetételű tápközegben (Yeast-Extract-Pepton-Medium, YEP) tenyésztjük: 2% pepton, 2% glükóz, 0,1% KH2PO4,2% agar, 1% élesztőextraktum, (pH-6,5). A sejtmasszát például a következő tápközegből nyerjük: 0,3% élesztőextraktum, 0,3% malátaextraktum, 2% glükóz és 0,5% pepton (pH-6,5). (A megadott koncentrációértékek csak példaképpen szolgálnak.) Ebből 20-30 órás kultúrákat nyerünk, a sejteket például centrifugálással választjuk el és a felhasználásig mélyhűtve tároljuk. A találmány szerinti egyik előnyös eljárásnál pél- dául olyan (I) általános képletű vegyületeket alkalmazunk, amelyek képletében R1 jelentése benzil-, 4-metil-ciklohexil-metil- vagy 4-terc-butil-ciklohexil-metil-csoport, R: jelentése metil- vagy etilcsoport és R3 jelentése hidrogénatom vagy valamely fenti aminovédőcsoport. A találmány szerinti eljárást előnyösen a következőképpen végezzük: a megfelelő ketosztatinvegyületet, különösen, ha az aminovédőcsoportot tartalmaz, 3- 10%-os etanolban oldjuk 0,05-0,5%, előnyöen 0,1— 0,2% mennyiségben, a teljes inkubációs térfogatra vonatkoztatva. A kapott etanolos oldatot 5-30%-os, előnyösen 10-20%-os vizes glükózoldathoz adagoljuk, amelyben előzőleg mélyhűtött élesztősejteket szuszpendáltunk. Az élesztőkoncentráció 0,5 és 5%, előnyösen 1 és 2% között váltakozik. A redukciót állandó keverés közben 25 és 30 'C között, előnyösen 28 °C hőmérsékleten végezzük, erjesztési körülmények között vagy enyhe levegőztetés mellett. Ez utóbbi különösen ipari méretek esetén előnyös. Az inkubációs idő 24-84, előnyösen 48-72 óra. Egy további előnyös kiviteli mód szerint az eljárást növekvő sejtek alkalmazásával is végezhetjük, mikor is az előtenyésztést előnyösen megtakaríthatjuk. Ilyen esetben a lehető legkevesebb etanolban oldott ketosztatint valamely irodalomból ismert tenyészkőzeghez [pl. 5% glükóz, 0,04% m-innozit, 0,1% KH2PO4, 0,1% MgS04, 0,45% kálium-hidrogén- tartarát, nyomelemek, vitaminok (pH-5-6)] adagoljuk, amelyben a sejtszuszpenziót szuszpendáltuk, majd a redukciót az előzőekben ismertetett, nyugvó sejteket tartalmazó közeg alkalmazásával végezzük. A kapott szekunder alkoholok feldolgozása, tisztítása és elemzése mindkét módszer esetében azonos. Ha a végtermék aminovédőcsoportot tartalmaz, a sejtszuszpenziót néhányszor szerves oldószerrel, így például etil-acetáttal, diklór-metánnal, dietil-éterrel vagy butil-metil-éterrel kirázzuk. Kívánt esetben egy további tisztítást is végezhetünk, például szilikagélen. Mivel a találmány szerinti eljárásnál az egyik enantiomer képződik nagy feleslegben, a tisztítást ismert módon, szelektív kristályosítással is végezhetjük. Ehhez a szerves fázist betöményítjük és a visszamaradó anyagot a ki/átkristályosításhoz alkalmas oldószerben oldjuk, kikristályosítjuk. Az enatiomerarány kimutatása és meghatározása ismert módon történik, így például vékonyréteg-kromatográfiával vagy HPLC-vel (nagynyomású folyadékkromatográfia). A kapott végtermékről kívánt esetben az aminovédőcsoportokat ismert módon lehasítjuk. Ha a megfelelő ketosztatin aminovédőcsoportot nem tartalmaz (R3-H), a redukció befejeződése után a szerves oldószerrel végzendő extrakciót általában nem alkalmazhatjuk, mivel a képződött alkohol aminovédőcsoportot nem tartalmazó formájában vízoldható és egy előzetes alkalizálás ciklizálásához vezet. Ilyen esetben a kapott alkoholt úgy nyerjük ki, hogy a sejteket elválasztjuk és a visszamaradó anyagot fagyasztva szárítjuk. A tisztítást és a kimutatást az előzőekben leírtakhoz hasonlóan végezzük. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös kiviteli módja szerint a redukciót immobilizált sejtekkel is végezhetjük. Ennél a módszernél a sejteket ismert módon szokásos hordozóanyagra, így például poliakrilamidgélre visszük fel, majd a hordozót aprítjuk és a továbbiakban a „szabad” sejteknél leírtakhoz hasonlóan alkalmazzuk a redukcióhoz. A reakciót szakaszosan vagy oszlopeljárás szerint egyaránt végezhetjük. A sejteket tartalmazó gélt többször is felhasználhatjuk, bár az immobilizált sejtek redukciós teljesítménye némileg csökken. Az extrakciót, ill. a tisztítást géltől való elválasztás után az eluátumból végezzük. A megfelelő ketosztatin redukálását a találmány szerinti eljárással sejtmentes extraktummal is végezhetjük. Ennél az eljárásnál a sejteket ismert módon homogeni5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
