203894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszforsavtartalmú szkvalén szintetáz inhibitorok és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 894 B 2 Azok a (D) általános képlett! kiindulási anyagok, amelyek képletében Z jelentése -(QkV és n értéke 2-től 5-ig terjedő egész szám, előállíthatók a [C] reakció vázlat szerint. Amint látható, először egy (VA) általános képlett! halogénszármazékot - Hal halogénatom, így bróm- vagy jódatom - reagáltatunk egy (IIIB) általános képlett! lítiumsóval. A reagáltatást, amelynek időtartama 1-től 24 óráig terjedhet, valamilyen szerves oldószerben, például tetrahidrofuránban vagy dietil-éterben, -78 és 0 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A keletkezett (VITA) általános képlett! foszfonsav-észtert ezután bázikus körülmények között, a [B] reakcióvázlat magyarázatánál megadottal azonos módon hidrolizálva kapjuk a megfelelő (II) általános képlett! vegyületet. Az (VA) általános képlett! vegyületeket hozzávetőlegesen ekvimoláris mennyiségű (IIIB) általános képletű lítiumsóval reagáltatjuk. A (IIIB) általános képletű lítiumsók egy (IIIB’) általános képletűfoszfonátból keletkeznek, ha azt valamilyen inert oldószerben, például tetrahidrofuránban vagy dietil-éterben, inert atmoszférában, például argongáz alatt, valamilyen lítiumforrásként szolgáló reagenssel, például butil-lítiummal reagáltatjuk. A lítiumforrásként szolgáló reagenst valamilyen inert szerves oldószerben, például hexánban oldva adjuk a reakcióelegyhez. A fenti szintézis kiindulási vegyületei, azaz az (VA) és (VB) általános képletű vegyületek vagy ismertek, vagy ismert eljárásokkal geraniolból vagy famezolból állíthatók elő. A (II) általános képletű kiindulási vegyületek közül azok, amelyek képletében Z jelentése egy -CH-CH- képletű csoport, a [D] reakcióvázlat szerint állíthatók elő. Az első lépés tulajdonképpen a Wittig-reakció Homer-Emmons-féle módosítása, miszerint egy (VIII) általános képletű aldehidet egy (IX) általános képletű tetraalkil(metilén-bisz-foszfonát)-tal, nátrium-hidrid jelenlétében, valamilyen inert oldószerben, például tetrahidrofuránban, toluolban vagy dietil-éterben, hozzávetőlegesen -20 és +25 °C közötti hőmérsékleten reagáltatunk. A reagáltatást 1 és 24 óra közötti időtartamig folytatva egy (X) általános képletű foszfonsav-észter keletkezik. A (X) általános képletű foszfonátok hidrolízisét bázikus körülmények között végezzük, a [B] reakcióvázlat ismertetése során már említett módon, aminek eredményeképpen egy (II) általános képletű foszfonsavhoz jutunk. A reakcióban részt vevő (VHI) általános képletű aldehid, illetve a (IX) általános képletű foszfonát mólaránya általában 1:1 és 1:2 közötti érték lehet. Ami a kiindulási vegyületként használt (VIII) általános képletű aldehideket illeti, például amelynek képletében Q kémiai kötést szimbolizál, geranial néven ismert anyag. Ugyancsak ismert vegyület a famezal, vagyis az a vegyület, ahol a (VIII) általános képletben Q jelentése egy -(CH2)2-C(CH3)-CH- képletű csoport. Más, kiindulási vegyületként használható aldehidek vagy alkoholok szintén vagy ismert vegyületek, vagy geraniolból, illetőleg famezolból szokványos kémiai szintézisekkel előállíthatók. Mindez a szakemberek számára nyilvánvaló. Az új köztitermékek, amelyek a találmány szerinti eljárás lényeges elemeként értékelendők, a (IV) általános képlettel - a képletben R5 jelentése hidroxilcsoport vagy klóratom - írhatók le. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek szkvalén szintetáz-inhibitorok, és mint ilyenek gátolják a koleszterin bioszintézisét, következésképpen a hiperkoleszterinémia és ateroszklerózis kezelésére alkalmasak. A szkvalén szintetáz aktivitásának gátlását az alábbi módon vizsgálhatjuk: Patkánymájból nyert mikroszóma-frakció szkvalén szintetáz aktivitását mérjük. A mérés során szubsztrátként famezil-difoszfátot használunk, és a keletkezett szkvalén mennyiségét gázkromatográfiás analízissel állapítjuk meg. A mérési módszert eredetileg Agnew írta le [Methods in Enzymology, 110: 357 (1985)], ez itt annak egy módosított és továbbfejlesztett változata. Mikroszóma-frakció elkülönítése patkánymájból 2-3 Sprague Dawley patkány fejét a törzstől elválasztjuk, a májakat kioperáljuk, és gyorsan jéghideg pufferoldatba helyezzük, amelynek összetétele a következő: 0,05 M kálium-foszfát, (pH-7,4), 0,004 M magnézium-klorid, 0,001 M etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) és 0,01 M 2-merkapto-etanol. A májakat alaposan átöblítjük, majd összeaprítjuk, és grammonként 2 ml hideg pufferoldattal egy Potter-Elvejhem-féle ho-. mogenizátorban homogenizáljuk. A homogenizátumot 4 °C-on, 10 percig 5000 g-vel centrifugáljuk, majd a., felülúszőt 2 réteg fátyolszöveten átengedjük, és ismételten centrifugáljuk 15 000 g-vel, 4 *C-on, 15 percig. Az így kapott felülúszőt is átszűrjük egy kétrétegű, fátyolszöveten, és harmadszor is centrifugáljuk, ezúttal 100 000 g-vel, 1 órán át, 4 °C-on. A centrifiigálás eredményeképpen összetömörödött mikorszómákat ezt követően az eredeti homogenizátum térfogatának egyötödét kitevő pufferoldatban ismét felszuszpendáljuk, és egy csiszolt üvegből készült homogenizálókészülék segítségével homogenizáljuk. A homogenizátumot ismert mennyiségű adagokra osztva -80 *C-on tároljuk. Ilyen körülmények között aktivitását legalább 2 hónapon át megőrzi. Az enzimaktivitás meghatározása A reakcióelegyet 50 ml-es, legömbölyített fenekű pyrex üvegből készült, szorosan záró, teflonbetétes csavaros kupakkal ellátott kémcsőben állítjuk össze. A csövet 4 *C-ra hűtjük, és sorrendben az alábbi komponenseket mérjük bele: 1. 0,275 M kálium-foszfát-puffer (pH-7,4) 0,36 ml 2. 55 mM kálium-fluorid 0,36 ml 3. 5,0 mM frissen készített nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) 0,36 ml 4. Víz vagy a vizsgálandó vegyület vizes oldata 0,36 ml 5. 21$ mM magnézium-klorid 0,36 ml 6. 15 pl mikroszomális enzim (0,48 mg mikroszomális fehérje pufferoldatban homogenizálva) 0,20 ml 1,80 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
