203888. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirazolo-piridin-gyűrűt tartalmazó mevalonsavszármazékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 888 B 2 alapanyagok - például kakaóvaj, polietilénglikol, lanolin vagy zsírsav-triglicerid - felhasználásával készítjük. A bőrön keresztül ható készítményekhez cseppfolyós paraffint, fehér vazelint, hosszúláncú alkoholokat, Macrogol-kenőcsöt, hidrofil kenőcsöt vagy hidrogél alapanyagót használunk fel. Az injekciók készítéséhez egyet vagy többet használunk fel a következők közül: polietilénglikol, hidrogél alapanyag, desztillált víz, injekció-minőségű desztillált víz, továbbá valamilyen kötőanyag, például laktóz vagy gabonakeményítő. Mindezen túlmenően, a találmányunk szerinti eljárással előállítható vegyületek kombinálhatók bázikus ioncserélő gyantákkal, amelyek képesek megkötni az epesavakat és ugyanakkor nem abszorbeálódnak a gyomor- és béltraktusban. Az (I) általános képlett! vegyületek napi dózisa 0,05-500 mg - célszerűen 0,5-50 mg - felnőtt emberek esetén. Az adagolásra 1-3-szor kerül sor naponta. A dózis természetesen változhat a kor, a testtömeg, a betegség súlyossága, vagyis a beteg állapota szerint. A (II)—(VTI) általános képlett! vegyületek újak és fontos intermedierek az (I) általános képlett! vegyületek előállításához. A következőkben részletesebb ismereteket adunk közre a találmányról az előállított vegyületek farmakológiái vizsgálati eredményeinek közlésével, valamint olyan példák bemutatásával, amelyek a hatóanyagok és a gyógyszerkészítmények előállítását ismertetik. Ezzel kapcsolatban azonban felhívjuk a figyelmet arra, hogy a bejelentett találmány nem korlátozódik az ismertetett, speciális példákra. Farmakológiai vizsgálatok: „A" vizsgálat: A koleszterin acetátból való bioszintézisének gátlása in vitro körülmények között Enzimoldatot készítettünk hím Wistar patkány májából olyan módon, hogy az epét 24 óránál hosszabb ideig ürítettük. A májat kivágtuk a sötét periódus félidejében és a homogenizált májból mikroszóma és felülúszó frakciót készítettünk Knauss és munkatársai, valamint Kuroda és munkatársai által leírt módszer szerint [Biochim. Biophys. Acta, 489.119 (1977)]. (A frakciót ki lehetett csapni 40-80 t%-os ammóniumszulfát-oldattal- „sup”-frakció.) A koleszterin bioszintézisre vonatkozó vizsgálathoz a mikroszóma (0,1 mg protein) és „sup”-frakciót (1,0 mg protein) két óra hosszat inkubáltuk 37 ’C-on 200 plnenynyiségű ATP-t, 1 mM glutationt, 6 mM glükóz-l-foszfátot, 10 mM NAD-ot, 0,25 mM NADP-t, 0,25 mM CoA-t, 0,04 és 0,2 mM (2-14C)nátrium-acetátot (0,2 fiCi), valamint - vízben vagy dimetil-szulfoxidban feloldva - 4 pl vizsgálat tárgyát képező vegyületet tartalmazó reakcióelegyben. A reakció megállítása, valamint elszappanosítás céljából 1 ml 15 t%-os etanolos kálium-hidroxid-oldatot adtunk a reakcióelegyhez, amelyet ezt követően 75 *C-on tartottunk egy óra hosszat. Az el nem szappanosítható lipideket petrőleuméterrel extraháltuk, majd a beépített '*C-es izotóp radioaktivitását számlálóval mértük. A vegyületek inhibitorhatását az IC50-es mólkoncentráció-értékkel adtuk meg. „B” vizsgálat: A koleszterin bioszintézisének gátlása a tenyészetben levő sejtekben Az 5. inkubálás után Hep G2 sejteket 12 mélyített lemezre helyeztük és mintegy 7 napon át - amíg a sejtek konfluensekké nem váltak - inkubáltuk őket Dulbecco által módosított Eagle-közegben (DME) - amely 10% föetális marhavérszérumot (FBS) tartalmazott - 37 *C-on, 5% CO2 jelenlétében. A sejteket 5% lipoprotein-hiányos szérumot (LpDS) tartalmazó DME-közeg hatásának tettük ki. (Az LpDS-t 24 órát meghaladó ultracentrifugálással készítettük.) A közeget vizsgálat előtt lecseréltük 0,5 ml friss, 5%-os LpDS- re, amely DME-t tartalmazott, majd beadagoltunk 10 pl vizsgálandó vegyületet vizes vagy dimetil-szulfoxidos oldatban. Beadagoltunk 20 pl (2-14C)nátrium-acetátot (0,2 pCi) adagoltunk be vagy közvetlenül a vizsgálandó vegyülettel együtt vagy azt követően, 4 óra elteltével (B-l, illetve B-2). A (2-14C)nátrium-acetáttal végzett 4 órás, további inkubálás után a közeget eltávolítottuk és a sejteket foszfáttal pufferolt, 4 *C-ra hűtött nárium-klorid-oldattal mostuk. A sejteket lekapartuk és PBS-sel tubusokba gyűjtöttük és 0,5 normálos káliumhidroxid-oldattal 37 *C-on digeráltuk. A digerátumból kipipettáztunk egy részt, hogy meghatározzuk a fehérjét A visszamaradó részt 75 ’C-on elszappanosítottuk egy óra alatt 1 ml 15 t%-os etanolos kálium-hidroxidoldattal. Az el nem szappanosodó lipideket extraháltuk petroléterrel és a HC-nek mértük a radioaktivitását. A beütésszámot korrigáltuk a sejtfehérjével és DPM/mg fehérjeértékben adtuk meg. A vegyületek gátlóhatását IC50-értékben fejeztük ki. „C” vizsgálat: A koleszterin bioszintézisének gátlása in vivo körülmények között Körülbelül 150 g-os hím Sprague-Dawley patkányokat normál Purina étrenden tartottunk, miközben tetszés szerint fogyaszthattak az állatok vizet Az állatokat 12 órás megvilágítási ciklusnak tettük ki (14 órától 02 óráig sötétben, majd világosban tartottuk), mielőtt felhasználtuk volna őket a koleszterin bioszintézisének gátlására irányuló in vivo vizsgálatokban. Az állatokat öt patkányt magukban foglaló csoportokba osztottuk olyan módon, hogy minden csoportban azonos legyen az átlagtömeg. A vizsgálat tárgyát képező vegyületeket 0,02-02 mg/kg testtömeg (0,4 ml/100 ml testtömeg) dózisokban feloldottuk vízben vagy szuszpendáltuk metil-cellulőzban (0,5%) és szájon keresztül beadtuk a patkányoknak 2-3 órával a sötét periódus felének elérése előtt (20 órakor), ami alatt, a koleszterin bioszintézise maximumot ér el a patkányokban. Kontrollként egyes patkányokat szájon keresztül csak vízzel vagy hordozóanyaggal etettünk. Másfél órával a minta beadagolása után a patkányoknak hashártyán keresztül beinjektáltunk 0,2-02 ml (10 pCi) (2-14C)nátrium-acetátot Két órával ezután vérmintákat vettünk és azonnal elválasztottuk a vérsavót Az összes lipidet extraháltuk Folch és munkatársainak módszere szerint, majd elszappanosítottuk etanolos káliumhidroxid-oldattal. Az el nem szappanosítható lipideket petroléterrel extraháltuk, majd mértük az el nem szappa-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
