203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 Anyagok és módszerek DNS-izolálás A friss vért egyenlő térfogatú 1»SSC oldattal meghígítottuk (SSC-sós nátrium-citrát, 0,15 M NaCl, 15 mM trinátrium-citrát, pH 7,0), Histopaque-1077 (Sigma) fölé rétegeztük, majd a magvas sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. Más esetben a fagyasztott vért kétszeres térfogatú 1*SSC pufferben olvasztottuk fel, és a magvas sejteket, valamint a sejtmagokat 15 percig 10 000 g-mal végzett centrifugálással ülepítettük ki. A nagy molekulasúlyú DNS-t Jeffreys, A. J. módszere szerint izoláltuk (Cell 18,1-10,1979). 10 1*SSC pufferben, és a bejelentés fő részében leírtak szerint autoradiografáltuk. Az adatok kiértékelése A szegregációs adatok tárolását és kiértékelését egy BBC model B típusú mikroszámítógép segítségével oldottuk meg. A 3. táblázat a neurofibromatózist hordozó családban előforduló miniszatellit-markereket foglalja össze. 3. táblázat apa anya Southern blott hibridizációs analízis hibridizációs próba 33.6 33.15 33.6 33.15 5 pg humán DNS-mintát 20 egység HinfI endonukleázzal emésztettünk 37 *C-on, 2 órán keresztül 4 mM 15 detektált fragmentek száma (n) 24 17 16 16 spermidin-triklorid jelenlétében, majd fenolos extrakallelikus párok száma (a) 3 3 2 4 cióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. Az emésztett kapcsolt párok száma (b) 1 0 1 0 DNS-mintát ezután 16 pl víz, 4 pl felvivő puffer (12,5% ficoll 400,0,2% brómfenolkék, 0,2 M Tris-ace20 a különböző azonosított lókuszok száma (c) 20 14 13 12 tát, 0,1 M Na-acetát, 1 mM EDTA, pH 8,3) és 2 pl 5 mg/ml ethidium-bromid elegyében feloldottuk, majd az összes lókusz becsült száma (N) 43 23 27 16 vízszintesen futtatott agarózgél-lapra vittük (0,7% Simga Type I agaróz, 40 mM Tris-acetát, 20 mM Naacetát, 0,2 mM EDTA, 0,5 pg/ml ethidium-bromid, pH 25 8,3; a géllapok 0,7 cm vastagok és 20 vagy 35 cm hosszúak voltak). A géllapot 10 percig ekvilibráltuk, majd 24-48 órán át elektroforetizáltuk 2 V/cm feszültségeséssel mindaddig, amíg minden 1,5 kilobázisnál rövidebb DNS-fragmentum ki nem futott a gélből. A 30 DNS-t ezután blott technikával nitrocellulóz filterre (Sartorius, pórusméret 0,45) vittük át. A 3íP-jelzett, egyszálú DNS-hibridizációs próbákat a 33.6 és 33.15 jelű, rekombináns M13 fágokból állítottuk elő, melyek humán miniszatellit-DNS-t tartalmaztak. A próbákat a 35 Southern blott mintákhoz hibridizáltuk 65 'C-on, A különböző azonosított lókuszok (c) számát a következő képlettel írhatjuk le: n-a-b. A teljes DNS-ujjlenyomat, amely az azonosíthatatlan fragmentumokat is tartalmazza, N darab heterozigóta lókuszból származik (2N fragment). Feltételezve, hogy az (n-b) számú azonosított különálló fragmentum véletlenszerűen választott ki az ujjlenyomat összes (2N számú) fragmentuma közül, a hipervariábilis lókuszok becsült teljes értéke (N) a kővetkezőképpen függ az adott hibridizációs próba által azonosított allelikus párok számától (a): >4 (n-b) (n-b-1) 2a +1 4. táblázat A hipervariábilis fragmentumok szegregációja, a neurofibromatózist hordozó családban átadódás Apa hány gyerekre egy fragmentum fragmentumpár adódott át az adott (AB vagy —) Anya egy fragmentum fragmentumpár (AB vagy—) agmentum (r) talált várt talált U várt 30 20 10 talált várt talált U 30 várt 20 1( 0 0 0,02 (0) 0 1 2 9 (0) 0,02 (0) 0 0 1 6 1 0 0,2 4 3 5 8 19 1 0,2 0 2 3 5 13 2 1 1,1 16 15 18 22 31 2 0,9 5 8 10 13 19 3 1 3,3 48 45 47 49 51 3 2,6 26 24 26 27 28 4 5 6,7 90 90 89 85 76 5 5,2 48 48 47 45 38 5 8 9a 113 127 121 114 95 6 ia 61 68 64 59 45 6 12 9,2 120 127 121 114 95 5 ia 77 68 64 59 45 7 10 6,7 89 90 89 85 76 6 5 a 52 48 47 45 38 8 4 3,3 58 45 47 49 51 4 2,6 23 24 26 27 28 9 0 U 19 15 18 22 31 0 0,9 7 8 10 13 19 10 0 0,2 4 3 5 8 19 0 0,2 1 2 3 5 13 11 (0) 0,02 (0) 0 1 2 1 9 (0) 0,02 (0) 0 0 1 6 átadódási gyakoriság 53,0±2,4% 47,7±2,7% 18
