203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 dúl: 16/61-0,26, ami összeegyeztethető a nem rokon észak-európaiakra vonatkozó korábbi becsléssel (x-0,2,2. hivatkozás). A 45 apa-specifikus fragmentumnak körülbelül fele adódott át B- re, Sl-re, és S2-re (sorrendben: 18, 24, 18), ahogy az heterozigóta-fragmentumok esetén várható. A 61 anyai fragmentumnak több mint a felét örökölte valamennyi leszármazott (B:32, Sl:38, S2:39, átlagosan: 36,3), ami várható volt, mivel az M ujjlenyomatában található fragmentumok egy része az apa DNS- ében is megvolt, s ezért ezeket a legtöbb (vagy az összes) utód örökli. Ha M DNS-ujjlenyomatai n apával közös - minden utódra átadódó -, és (61-n) heterozigóta - az utódok felére átadódó - fragmentumot tartalmaznak, akkor n+0,5(61-n)-36,3, ahonnan N-12, ami összeegyeztethető azzal a korábbi becsléssel, hogy az apa és M DNS-ujjlenyomataiban 16 közös fragmentum van (lásd fent). X DNS-ujjlenyomatai 21 apa-specifikus fragmentumot és 40 M-mel közös fragmentumot tartalmaznak. Az anya-specifikus fragmentumok száma, melyek az apa DNS-ujjlenyomataiban nincsenek jelen, kétféleképpen is becsülhető. Először: az anya-specifikus fragmentumok száma durván, meg kell, hogy egyezzen az apa-specifikus fragmentumok számával, azaz 45/2-22,5. Másodszor, X 40 „anyai” fragmentuma közül n (kb. 12) az apa DNS-ében is megtalálható, így X DNS-ében 28 anya-specifikus fragmentum marad. Ezért az X által örökölt, anya-specifikus fragmentumok száma kb. 25. A DNS-ujjlenyomatok csíkjai közös előfordulásának valószínűsége: Annak átlagos valószínűségét, hogy egy DNS-ujjlenyomat egy fragmentuma egy másik, véletlenszerűen kiválasztott személy DNS-ujjlenyomatában is előforduljon (azonos elektroforetikus mobilitással és autoradiográfiás intenzitással) x-szel jelöljük (x-0,2-0,26, lásd fent). A nagyobb miniszatellit-fragmentumok ritkábban fordulnak elő véletlenszerűen 2 ujjlenyomatban egyszerre, ami valószínűleg a kisebb allélgyakoriságnak és a jobb elektroforetikus felbontóképességnek köszönhető, ezért a fragmentumok közös előfordulásának x valószínűsége mérettől függően heterogén. Mivel majdnem mindegyik fragmentum függetlenül öröklődik, annak maximális valószínűsége, hogy 2 véletlenszerűen kiválasztott személy DNS-ujjlenyomatának mind az n fragmentuma közös legyen x1; és x értékének minden heterogenitása tovább csökkenti ezt a valószínűséget. Közös csíkok előfordulása testvérek DNS-ujjlenyomataiban: Amennyiben a közös csíkok minden esetben ugyanazon hipervariábilis lókusz azonos alléljét jelentik, akkor x a következő módon függ az átlagos allélgyakoriságtól (q): x-2q-qJ, amiből levezethető, hogy annak valószínűsége, hogy egy személy DNS- ujjlenyomatában jelen lévő valamely fragmentum testvére ujjlenyomatában szintén megtalálható: (4+5q-6q2+q3)/4(2-q). Mivel x-0,26, q-0,14, így két testvér DNS-ujjlenyomatának csíkjai 0,62 részben közösek. Ez a valószínűség egy kicsit kisebbnek adódik, ha feltételezzük, hogy a különböző véletlenszerűen kiválasztott emberek DNS-ujjlenyomatainak közős csíkjai sohasem azonos alléleket jelentenek, vagyis sok miniszatellit-régiónak vannak azonos méretű alléljei. A DNS-ujjlenyomatok alkalmazása öröklődő betegségek vizsgálatában Annak eldöntése céljából, hogy a DNS-ujjlenyomatok alkalmasak-e emberi öröklődésbeli kapcsoltságok vizsgálatára, különös tekintettel olyan hipervariábilis DNS-fragmentumok azonosítására, melyek nagy családokban együtt szegregálódnak bizonyos betegségekért felelős lókuszokkal, két nagy család DNS-ujjlenyomatait vizsgáltuk meg. Az egyik családban a neurofibromatózis szegregációját kísértük figyelemmel, a másik családban pedig a magzati hemoglobin örökletes fennmaradásának szegregációját, amely valószínűleg egy olyan domináns, autoszomális génhez kötött, amelyik nem mutat kapcsoltságot a ß-globin-gön klaszterrel. 8. példa Hipervariábilis miniszatellit-fragmentek szegregációja egy neurofibromatózist hordozó családról készített DNS-ujjlenyomatokban. A vérből származó DNS-mintákat HinfI restrikciós endonukleázzal emésztettük, 35 cm hosszú 0,7%-os agarózgél-lapon elektroforetizáltuk, majd Southern blott analízisnek vetettük alá a 33.6 és 33.15 jelű miniszatellit-hibridizációs próbák segítségével. A 7. ábrán bemutatjuk a betegséget nem hordozó apáról (F), 5 fiáról (S) és 6 lányáról (D) készült DNS-ujjlenyomatokat; a betegséget hordozű anyáról nem volt lehetőségünk DNS-ujjlenyomatot készíteni. A neurofibromatózist többszörösen hordozó leszármazottakat (+) jellel jelöltük, a többi leszármazott a neurofibromatózis semmi jelét sem mutatta. Az azonosított heterozigóta apai (•) és anyai (o) eredetű DNS-fragmentumokat megjelöltük, és ezeknek az utódokban történő elkülönülését közvetlenül az eredeti autoradiogrammok alapján detektáltuk, úgy, hogy azokat minden esetben rövid, közepes és hosszú ideig is exponáltuk. Csak azokat a fragmentumokat vettük számításba, melyeknek mind a pozíciója, mind a relatív radioaktív intenzitása minden utódban megegyezett a megfelelő szülői fragmentummal. Az olyan kapcsolt AB DNS-fragmentumokat, melyeknek utódokbeli szegregációja AB vagy — alléleket eredményezett, folyamatos vonallal kötöttük össze, míg pontozott vonal kapcsolja össze azokat a fragmentumokat, melyek szegregációja A- és -B alléleket is eredményez. Csillaggal jelöltünk egy olyan anyagi fragmentumot, melynek öröklődése kapcsoltságot mutat a neurofibromatózis öröklődésével; mind a hat megbetegedett utód örökölte ezt a fragmentumot, az öt egészséges gyermek közül pedig négyben nincs meg ez a fragmentum, így e fragmentum és a neurofibromatózis öröklődése között 10/11 arányú összhang áll fenn. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17
