203792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás optikailag aktív 2-fenil-propionsavak mikrobiológiai előállítására
1 HU 203 792 B 2 1. példa a) A Brevibacterium R 312 (CBS 717,73) törzset fiolákban tenyésztjük 28 "C-on, 14 órán keresztül, az alábbi összetételű közegben: glükóz 10 g (NH<)2S04 5g KH2PO4 1,01 g Na2HP(V12H20 1,64 g K2HPC>4 0,82 g CaCWftO 0,012 g ZnCl2 0,0012 g FeSCV7H20 0,0012 g MnSOHjO 0,0012 g MgS04*7H20 0,5 g tiamin*HCl 0,002 g víz q.s. 1000ml-hez. Ezt az elötenyészetet a tápközeg beoltására használjuk, amelynek az összetétele a fentiekkel megegyezik, azonban 20 mM koncentrációban N-metil-acetamidot is tartalmaz. A tenyésztést 24 órán keresztül 28 "C-on végezzük, keverés közben. A kapott biomasszát centrifugálással elkülönítjük, és kétszer nátrium-klorid-oldattal (9 g/1) mossuk. b) A centrifuga üvegébe, amely 13 mg Brevibacterium R 312 sejtet tartalmaz, szárazanyagban kifejezve, 2 ml (50 mM) foszfátpuffer-oldattal szuszpenziót készítünk, amelynek pH-értéke 7. Majd 25 mg (190 pmól) racém 2-fenil-propionitrilt adunk hozzá. 24 órán keresztül keverjük 25 "C-on, a reakcióelegyet 23 ml acetonitril és 1 n hidrogén-klorid-oldat 90:10 térfogatarányú elegyével hígítjuk. A baktériumokat centrifugálással távolítjuk el. A felülúszó összetételét nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással határozzuk meg. A felülúszó 119 pmól racém és (R)-2-fenil-2-propionsav-amidot és 62 pmól (S)(+)-2-fenil-propionsavat tartalmaz. Nátrium-kloridot adunk hozzá, hogy a szerves és a vizes fázis elkülönülését elősegítsük. A szerves fázist bepároljuk, és a kapott maradékot 20 ml kloroform és 0,1 n nátrium-hidroxid 1:1 térfogatarányú elegyével felvesszük. A lúgos fázist sósavval megsavanyítjuk és kloroformmal extraháljuk. Az optikai foigatóképesség meghatározása szerint az enantiomer- tartalom (optikai tisztaság) (S)(+)-izomere 100%. [a]j?—1-390 (c-0,01, etanolban). Az (S)(+)-2-fenil-propionsav optikai tisztasága az (R)(+)-a-metil-benzil-aminnal végzett származékképzés után végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis szerint 96,4%. 2. példa a) Coiynebacterium N 771 (FERM P-4445) törzset tenyésztünk fiolában 28 "C-on, 14 órán keresztül keverés közben az alábbi közegben:- élesztőkivonat 3 g- malátakivonat 3 g- baktopepton 5 g- glükóz 10 g- FeSOWHjO 0,1 g- víz q.s. 1 literhez. Az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be nátrium-hidroxidoldat hozzáadásával, sterilezés előtt. Ezt az elötenyészetet használjuk fel, hogy azonos táptalajt 1/40 részével beoltsunk, azonban ehhez még literenként 5 ml ketoprofén-nitril acetonitrillel készített oldatát (0,2 g/ml) adjuk. 24 órán keresztül inkubáljuk, 28 'C-on és a fiolát közben keverjük. A kapott biomasszát centrifugálással elkülönítjük, majd kétszer nátrium-klorid-oldattal (9 g/1) mossuk. b) A centrifuga üvegében lévő 72 mg (szárazanyagra számított) Corynebacterium N 771 sejttel és 2 ml (50 mM) foszfátpuffer-oldattal, amelynek pH-ja 7, szuszpenziót készítünk. 25 mg (167 pmól) racém 2-fenil-propionsav-amidot adunk hozzá, majd 24 órán keresztül keverjük 25 "C-on A reakcióelegyet az 1. példa szerinti eljárással kezeljük. A felülúszó 110 pmól racém és (R)-2-fenil-2-propionsav-amidot és 34 pmól (S)(+)-2-fenil-propionsavat tartalmaz. A 2-fenil-propionsav enantiomer-tartalma (optikai tisztaság) az optikai foigatóképesség meghatározása, illetve (R)(+)-a-metil-benzil-aminnal végzett származékképzés után 100, illetve 95% (S)(+)-2-fenil-propionsav. 3. példa Az 1. a) példa szerint előállított 13 mg (szárazanyagban kifejezve) Brevibacterium R 312 sejttel és 2 ml (50 mM) foszfátpuffer-oldattal, amelynek pH-ja 7, szuszpenziót készítünk. 25 mg (167 pmól) racém 2-fenil-propionsav-amidot adunk. 24 órán keresztül keverjük 25 "C-on. A reakcióelegyet az 1. példa szerinti eljárással kezeljük. A felülúszó 95,2 pmól racém és (R)-2-fenil-propionsav-amidot és 56,1 pmól (S)(+)-2-fenil-propionsavat tartalmaz. A 2-fenil-propionsav enantiomer-tartalma az optikai foigatóképesség mérése, illetve (R)(+)-a-metil-benzilaminnal végzett származékképzés után 99, illetve 95% (S)(+)-2-fenil-propionsav. 4. példa Az 1. a) példa szerinti eljárással nyert 66 mg (szárazanyagban kifejezve) Brevibacterium R 312 sejttel 2 ml (50 mM) kálium-foszfát-puffer-oldattal, amelynek pH-ja 7, szuszpenzióba viszünk. 25,9 mg (102 pmól) racém 2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot adunk hozzá. 72 órán keresztül keverjük 25 "C-on. A reakció-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
