203789. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikokcidiális és növekedést serkentő hatású policiklusos savas éter-típusú antibiotikumok előállítására
1 HU 203 789 B 2 Közben rázott lombikokat készítünk elő, valamelyik következő táptalaj alkalmazásával: C’ táptalaj Gramm/liter cerelóz 10 szójaliszt 10 fermentációs maradék (kukorica) 5 kukoricakeményítő 10 nátrium-klorid 5 kobalt-klorid 0,002 kalcium-karbonát 1 JDYTT táptalaj Gramm/liter cerelóz 10 kukoricakeményítő 5 kukoricalekvár 5 enzimes kazeinhidrolizátum 5 kobalt-klorid 0,002 kalcium-karbonát 3 100-100 ml táptalajt töltünk 300 ml-es rázott lombikokba és a lombikokat 120 *C-on 30 percen át 100 kPa nyomáson sterilizáljuk. Lehűlés után a táptalajt vegetatív sejtszuszpenzióval oltjuk be, amelyet az említett Actinomadura sp. ferde agar tenyészetéről kaparással nyertünk ki. A lombikokat 28 *C-on rázógépen rázatjuk 5-7 napon át [elmozdulás: 3,81-6,35 lus/pere (CPM)]. cm, 150-200 cik-Időközben 5 literes fermentációs tankokat készítünk elő, amelyek 3-3 liter előbbi, C vagy JDYTT táptalajt tartalmaznak, vagy alkalmazhatjuk a következő táptalajt is: UK 1-2 Gramm/liter cerelóz 45 szójaliszt 10 kukoricalekvár 10 kobalt-klorid 0,002 magnézium-szulfát 0,10 kalcium-karbonát 3 mangán-szulfát 0,10 vas(III)-szulfát 0,10 A táptalajhoz 1 ml habzásgátlő szert (P2000, 10 tömeg% etilén-oxidot tartalmazó polipropilénglikol) adunk, az edényeket lezárjuk és 45 percen át 120 °C-on, 100 kPa nyomáson sterilizáljuk. Az edényeket ezután 1 rázott lombikkal oltjuk be (kb. 3% inokulum). A fermentációt 30 ‘C-on 120-168 órán át végezzük, 1700 fordVperc kevertetési sebességgel (RPM), percenként 1 térfogat levegő/1 térfogat közeg levegőztetési sebességgel. A fermentáció befejeződését B. subtilis ATCC 6633- mal végzett antibiotikum korongpróba alapján határozzuk meg. A fermentorokat ekkor leállítjuk és a fermentlevet természetes pH-n szűrjük, diatómaföld alkalmazásával. A szűrőlepényt metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót vákuumban töményítjük, 2-3 térfogat vízzel hígítjuk, majd kétszer extraháljuk 1/3—1/2 térfogat metil-izobutil-ketonnal vagy n-butanollal. Az oldószeres réteget leszívatással vagy centrifugálással különítjük el a vizes fázistól, majd porlasztás után vákuumban betöményítjük. Nyers alakban, viszkózus olajként az (I) képletű antibiotikumot kapjuk. A fermentlé bioaktivitása és a fermentáció utáni kinyerési lépések érzékeny Bac. subtilis ATCC 6633 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538 törzs alkalmazásával követhetők. A fermentlében jelen levő komponensek és a kinyerési lépésekhez tartozó anyagok Analtech GF szilikagél-lemezek alkalmazásával mutathatók ki vizuálisan, eluálószeiként etil-acetát alkalmazásával. A futtatólemezeket vanillin reagenssel permetezzük be (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85%-os foszforsavban) és 80 *C-ra melegítjük fel. Az (I) képletű antibiotikum bíborszínű foltként jelenik meg. Eljárhatunk úgy is, hogy a futtató TLC lemezt agárral rétegezzük felül, beoltjuk S. aureus-szal vagy B. subtilis-szel - amely tenyészethez 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólium-klorid-monohidrátot adtunk - és a tenyészetet 37 *C-on 16 órán át inkubáljuk az antibiotikum vizuális kimutatására (fehér foltok biborszínű háttérrel szemben). A nagy fermentorokban való tenyésztésre úgy térünk át, hogy rázott lombiktenyészeteket állítunk elő, 0,7 liter C’ vagy JDYTT táptalaj alkalmazásával. A rázott lombikinokulumot 5-7 napon át 28 *C-on te?nyésztjük és ezt használjuk fel 200 vagy 6000 literes - fermentációs tankok beoltására, amelyek 100, ill, 4000 liter UK1-2 táptalajt tartalmaznak. Tankonkéntkb. 1 liter inokulumot használunk fel. 7-10 napon át végzett fermentáció után a tenyésztést leállítjuk. A kisebb fermentációkból kapott teljes fermentlevet természetes pH-n 50 liter metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. A szerves kivonatot vákuumban ciklon desztillálóval és forgó bepárlóval olajjá töményítjük. -Az olajat kétszer kromatografáljuk, hexánban szuszpendált 500 g „oszlop” tisztaságú szilikagélen. Az első oszlopot etil-acetáttal, a másodikat pedig 1:1 kloroform: aceton eleggyel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat TLC-vel azonosítjuk, az előbbiekben leírt módszer alkalmazásával. Végül a második szilikagéloszlopról kapott aktív frakciókat florisilen kromatografáljuk, eluálószeiként 19:1 kloroform: metanol elegy alkalmazásával. A termékfrakciókat egyesítjük, híg foszforsavval, majd dinátrium-hidrogén-foszfát-pufiferrel kirázzuk - a nátriumsó előállítására -, nátrium-szulfát fölött szárítjuk, sztrippeljük és a maradékot éterből kristályosítjuk. így az (I) képletű vegyület nátriumsójához jutunk (915 mg). Op.: 245-249 "C [a]2f—19,0* (c-1, metanol) Elemzési eredmények: a C^H^OiiNa képletre számított C 62,47 H 8,97%; talált C 62,89 H 9,22%. 13C-NMR (kémiai eltolódás - ppm - CDCb-ban; zárójelben a hidrogénatomok számát tüntetjük fel): 182,8 (0), 110,0 (0), 106,0 (0), 99,1 (1), 87,2 (1), 86,9 (0), 86,2 (1), 86,2 (0), 84,8 (1), 83,4 (0), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
