203787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 HU 203 787 B 2 A találmány tárgya fermentációs eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására. A 2-keto-L-gulonsav fontos közbenső termék az L-aszkorbinsav szintézisénél. A 2-keto-L-gulonsavat, amely az L-aszkorobinsav szintézisénél fontos közbenső termék, ipari méretekben az úgynevezett Reichstein-eljárással állítják elő [Helvetica Chimica Acta 17, 311 (1934)]. Ez az eljárás azonban több lépésből áll és igen nagy mennyiségű oldószert igényel, ezért modem ipari eljárásként már nem megfelelő. A Reichstein-módszeren kívül más módszerek is ismeretesek, amelyek mikroorganizmusok alkalmazásán alapulnak. Ismert például a 2 421 611 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból egy eljárás, amely abból áll, hogy a D-glukózt mikrobiológiai oxidációnak vetjük alá, így 5-keto-D-glukonsav keletkezik, azt kémiai vagy mikrobiológiai úton redukálva kapjuk az L-idonsavat, ebből mikrobiológiai oxidálással nyerhető a 2-keto-L-gulonsav. A 39 14 493,53 25 033,56 15 877 és 59 35 920 számú japán közzétett szabadalmi leírásból ismeretes egy eljárás, amely abból áll, hogy D-glukózt mikrobiológiai úton oxidálnak és így 2,5-diketo-D-glukonsavat kapnak, amelyet mikrobiológiai vagy kémiai úton redukálva nyerik a 2-keto-L-gulonsavat Ezen eljárások hátránya, hogy kémiai redukciós lépéseket alkalmaznak, nevezetesen az első eljárásban az 5-keto-D-glukonsavat redukálják idonsavvá, a második eljárásban a 2,5-diketo-D-glukonsavat redukálják 2- keto-L-gulonsawá, ezért feltétlenül jelentkeznek a sztereospecifikusság problémái, valamint különféle melléktermékek, így D-glukonsav és 2-keto-D-glukonsav keletkezése, ami a kitermelést csökkenti. Amikor pedig a redukciót mikrobiológiai úton végzik, a mikroorganizmus számára redukciós energiaforrásként igen nagy feleslegben kell alkalmazni cukrot. Ez szintén a kitermelést csökkentő tényező. Amikor a kiindulási anyag L-szorbóz, a 2-keto-L-gulonsavat egyetlen oxidációs lépéssel elő lehet állítani. Számos kísérlet is történt ennek az előnynek a kihasználására bizonyos, hogy a Gluconobacter, Pseudomonas, Serratia, Achromobacter és Alcaligenes nemzetséghez tartozó baktériumtörzsek felhasználásával [lásd: Biotechnology and Bioengineering, 14, 799 (1972); 41-159 és 41-160 számú japán közzétett szabadalmi bejelentések; 3 043 749 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 526 660 számú szovjet szabadalmi leírás; 49-39 838 számú japán közzétett szabadalmi bejelentés; Acta Microbiological Sinica 20, 246 (1980); 21,185 (1981); 62-48 389 számú japán közzétett szabadalmi bejelentés]. Mindazonáltal az ismertetett törzsek felhasználásával a kitermelés kicsi, ezért ezek az eljárások ipari méretekben nem alkalmazhatók. A közelmúltban ismertettek egy eljárást 2-keto-L-gulonsav előállítására D-glukózból. Az eljárás baktériumtörzset alkalmaz, amelyet úgy állítanak elő, hogy egy Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus 2,5-diketo-L-glukonsav-reduktáz génjét egy Erwinia mikroorganizmusba építik be a DNS-rekombinációs technika szerint [lásd: Science, 230, 144 (1985)]. Azonban ezzel az eljárással sem lehet ipari méretekben elegendő mennyiségű 2-keto-L-gulonsavat előállítani. A találmány célja: az ismertetett körülmények miatt kísérleteket végeztünk iparilag alkalmazható előnyös eljárásra 2-keto-L-gulonsav előállítására. Ennek eredményeképpen már korábban is azt találtuk, hogy a talajból izolált és Pseudogluconobacter saccharoketogens-nek nevezett baktériumok jelentékeny mennyiségű 2-keto-L-gulonsavat képesek termelni L-szorbózból (lásd: a 221 707 számú európai közzétett szabadalmi leírást). A későbbiekben ennek az eljárásnak a javításán dolgozva nem várt módon azt tapasztaltuk, hogy 2- -keto-L-gulonsav L-szorbózból történő előállítása során a fermentációs idő lerövidíthető és a kitermelés lényegesen megnő, ha a baktériumtörzset olyan tápközegben tenyésztjük, amelyhez ritkaföldfémet adunk. Korábban a ritkaföldfémek ilyen fermentációt elősegítő tulajdonságát nem ismerték. A találmány tárgya tehát javított eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására L-szorbózból. A találmányunk tárgyát és előnyeit a következő leírásból a szakterületen jártas szakember könnyen megértheti. A találmány szerinti javított eljárást 2-keto-L-gulonsav előállítására úgy végezzük, hogy egy, a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust, amely az L-szorbózt 2-keto-L-gulonsavvá képes oxidálni, L-szorbóz jelenlétében olyan tápközegben tenyésztünk, amely 0,000001-0,1 t/tf% ritkaföldfémet is tartalmaz. Ha ezt a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust, amely az L-szorbózt 2-keto-L-gulonsavvá képes oxidálni, ritkaföldfém jelenlétében tenyésztjük, akkor hatékonyabban tudjuk előállítani a 2-keto-L-gulonsavat, amely fontos kiindulási anyag az L-aszkorbinsav szintézisénél. A találmány szerint alkalmazott, a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmusok közül példaként megemlítjük a következő mikroorganizmus törzseket, amelyeket már a 221 707 számú európai szabadalmi közzétételi iratban is ismertettünk: Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s: FERM BP-1130, IFO 14 464; Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5: FERM BP-1129, IFO 14 465; Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86: FERM BP-1128, IFO 14 466; Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15: FERM BP-1132, IFO 14 482; Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4: FERM BP-1131, IFO 14 483; Pseudogluconobacter saccharoketogenes 22-3: FERM BP-1133, IFO 14 484. A továbbiakban ezeket a Pseudogluconobacter saccharoketogenes baktériumokat mint oxidációs baktériumokat említjük. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott ritkaföldfémek közül példaként megemlítjük a szkandiumot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
