203786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés szénhidrát-tartalmú táptalajok folyamatos fermentálására baktériumokkal
1 HU 203 786 B 2 A találmány tárgya eljárás szénhidráttartalmú táptalajok fermentálására baktériumokkal, melyek butanolt, acetont, etanolt és/vagy izopropanolt termelnek. Az eljárást legalább két lépésben végezzük, és az első lépésben a baktériumokat lényegében folyamatosan tenyésztjük, és a második, folyamatosan vagy szakaszosan végrehajtott lépésben lényegében a terméket termeljük. A találmány tárgyát tekintve legközelebbi „technika állásának” W. J. Groot et al. cikke tekinthető [Biotechnol. Lett. G (12), 789-792, 1984], A találmány szerinti eljárás az ott ismertetettől mindenekelőtt abban tér el, hogy az előbbit két lépésben hajtuk végre és a baktériumok rögzítését nem egy gélbe való bezárással, hanem hordozóanyagon történő adszorpcióval, illetve adhézió segítségével oldjuk meg. Ez az eljárási mód lehetővé teszi a baktériumok rögzítőanyagtól független tenyésztését és a baktériumtenyészet állandó felfrissítését, aminek következtében a második fázisban a baktériumok aktivitása állandó szintű. Az eljárás során alkalmazotthoz hasonló berendezéseket ismertet H. Nagashima et al., Biotechnoi. Bioeng. 26, No. 8, 992-997, 1984. Az eddig ismert eljárások lényegében két egymást követő tenyésztési lépésből állnak, ahol az átfolyási sebességgel, illetve a foszfátszabályozással az eljárás folyamatát úgy szabályozzák, hogy az első lépésben (növesztési lépésben) a baktériumkoncentráció állandóan magas marad, azaz egy folyamatos egyensúly (steady state) alakul ki, és a szubsztrát egy része már butánollá, acetonná és/vagy etanollá alakul. A második lépés célja ezután a fermentációs termék minél magasabb fokú termelése a lehető legrövidebb időn belül. Ha az első lépésben túl magas átfolyási sebességet állítanak be, akkor több sejtet vonnak el, mint amennyi új sejt képződik. Túl alacsony átfolyási sebesség esetén viszont a sejtnövekedés leállhat. Az ilyen eljárás hátránya, hogy egyrészt a kívánt termék hozama nem kielégítő, másrészt a folyamatos tenyészet stabilitása nem kielégítő, így hosszú időn keresztül, azaz 100 órás, vagy annál is hosszabb fermentálási idő alatt nem érhető el kellően állandó kitermelés. Ennek oka, hogy a keletkezett termékek, azaz a butanol, aceton, etanol és/vagy izopropanol a fermentációnál alkalmazott mikroorganizmusokra toxikusak, ezáltal a képződött termék meghatározott koncentáricójánál vagy a termékképzés áll le, vagy maga a baktériumtenyészet is jelentősen károsodik. További hátránya az ismert eljárásnak, hogy az egyébként is csak félig kielégítő eredmények is csak hexózokkal érhetők el. A találmány célkitűzése tehát olyan fentiekben említett jellegű eljárás kidolgozása, mellyel hosszú időn keresztül állandó és előnyös termelési szint tartható fenn. Ugyancsak feladata a találmánynak olyan eljárás kidolgozása, melyben nemcsak hexózok alkalmazhatók. A fenti cékitűzést a találmány szerint úgy valósítjuk meg, hogy a második eljáráslépésben a baktériumokat egy hordozóanyagon immobilizáljuk. Egylépéses eljárásoknál már ismeretes baktériumok immobilizálása, mégpedig ennél az ismert eljárásnál sejteket kalcium-alginátban immobilizálnak, és szubsztrátként glükózt alkalmaznak. Bár ezeknél az ismert eljárásoknál a termelés növelhető, hosszabb ideig, például néhány héten át tartó fermentációs idő után már csak alacsony termelés volt fenntartható. A találmány szerinti eljárás során az átfolyási sebesség igen rugalmas, mivel az életképes baktériumok a második lépésben adhézió következtében a hordozóanyagon kötve maradnak, és így az első eljárási lépés úgy határozható meg, hogy az első lépésben lényegében csak baktériumok keletkezzenek, melyek azután részben átkerülnek a második lépésbe. A második eljárási lépésben igen nagy koncentrációjú baktériumtenyészetet nyerünk, mivel az életképes baktériumok a hordozóanyaghoz kötődnek, míg a már elpusztult baktériumsejtek a termékben dús tápoldattal együtt eltávoznak. Ily módon az első lépésben olyan magas átfolyási sebességgel dolgozhatunk, hogy a keletkezett termék koncentrációja ne lépje túl a toxicitási határt, és így a baktériumtenyészet lényegében nem károsodik. Előnyösen hordozóanyagként nyíltpórusú zsugorított üveget vagy habkövet, vagy valamely magas szilíciumdioxid-tartalmú, nyíltpórusú, 20-200 mikrométer, előnyösen 50-100 mikrométer pórusméretű és legalább 0,35 ml/cm3 vízfelvevő képességű, azonos értékű anyagot alkalmazunk, ahol a hordozóanyag és a teljes munkatérfogat aránya 1:10 és 1:1,1 közötti, előnyösen 1:5- 1:6, mely esetben különösen hatékony fermentáció érhető el, főleg, ha az első eljárási lépésben a reaktor átkeverése mellett, 0,08-0,45‘h'1, főleg 0,1—0,38*h_1 átfolyási sebességet, 4,0-5,5 főleg 4,3-5,1, előnyösen 4,5-5 pH-értéket és/vagy 30-40 °C, főleg 33—38 °C hőmérsékletet tartunk, míg a második lépésben az átfolyási sebesség 0,14-0,44t1, előnyösen 0,25-0,35*h~\ a pH-érték 3,0-5,0, főleg 4,0—4,8, előnyösen 4,2-4,5, és/vagy a hőmérséklet 27-40 °C, főleg 30-37 “C, előnyösen 32-35 "C. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a termelési lépésből a tápoldatot elvezethetjük, a keletkezett terméket extrakciós úton, előnyösen önmagukban ismert módszerekkel, hosszú láncú alkoholokkal vagy zsírsavakkal elválaszthatjuk, majd a kapott termékben szegény fázist a termelési lépésbe és/vagy az első eljárási lépésbe visszavezethetjük. Ily módon elérhető, hogy a második eljárási lépésben a termék koncentrációját alacsony értéken tarthassuk, így a baktériumok nem károsodnak, és a termelés foka állandó magas értéken tartható, mégpedig igen hosszú időn (több mint 500 órán) át. A termék azonban a második eljárási lépésben előnyösen folyamatos bepárlással is elválasztható a táptalajtól. Erre a bepárlással történő termékelválasztásra főleg szilikonkaucsukból készült bepárló membránt alkalmazhatunk, és a hőmérsékletet 30-90 °C, előnyösen 40- 80 °C értéken tartjuk, és a lepárlási oldalon a gőznyomáscsökkenést egy hordozógázzal, például nitrogénnel, hidrogénnel, szén-dioxiddal, vagy ezen gázok elegyével, vagy egy fermentációs gázzal, illetve vákuum létesítésével biztosítjuk. Ugyanakkor azonban a második reakció5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
