203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 64 pg/ml. Utána a frakciókat dializáljuk vagy Sephadex G 25-ön (Pharmacia) sómentesítjük. Az SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis (7) az Na-acetil-eglin-C-re kb. 8100 Dalton molekulasúlyt ad. c)Az anhidrokimotripszin-oszlop készítése A. Anhidroldmotripszin előállítása (AnCht) Az AnCht-t Ako et al. (27) szerint állítjuk elő: 500 mg kimotripszint (Merck) 50 ml 0,1 M Tris*HCl-pufferben (pH 8), amely 0,1 M NaCl-t, 0,12 M CaCU-t és 13% (v/v) metanolt tartalmaz, oldunk. Ehhez az oldathoz hétszer fenil-metán-szulfonil-fluorid (PMSF), (Fluka, 7 mg/ml acetonos oldat) 0,1 ml-es alikvotjait adjuk keverés közben és minden alkalommal meghatározzuk a kimotripszin-aktivitás csökkentését (28). Miután a kimotripszin-aktivitás 1% alá süllyedt, az oldatot 1 mM HCl-lel szemben egy éjszakán át 4 °C-on dializáljuk (3*10 liter) és ezt követően liofilizáljuk. A képződött fenil-metán-szulfonil-kimotripszint (PMSCht) 100 ml jéghideg 0,1 M KOH-ban oldjuk, egy órán át jégben állni hagyjuk és utána a pH-ját 6 N HCl-lel pH 3-ra állítjuk. A kapott oldatot egy éjszakán át 4 °C-on 1 mM HCl-lel szemben dializáljuk (3*10 liter) és utána liofilizáljuk. Az AnCht-t fehér por formájában kapjuk (120 mg). B. AzAnCht-oszlop előállítása A gyártó adatai szerint Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) hideg deszt. vízzel és pH 8,5-ös kapcsolópufferrel (0,1 M NaHC03-oIdat) mosunk. A gél kapcsolópufferrel (4 ml) készített 50%-os szuszpenzióját műanyag csőbe visszük, azonos mennyiségű anhidrokimotripszin-oldattal (120 mg 4 ml kapcsolópufferben) elegyítjük és egy éjszakán át 4 *C-on forgatjuk a csövet. A gélt utána kapcsolópufferrel mossuk. A fennmaradt szabad aktív helyeket úgy blokkoljuk, hogy a gélt gél ml-enként 0,1 ml 1 M etanol-amin-HCl-lel (pH 8) 3 órán át 4 *C-on kezeljük, majd foszfátpufferrel készített, gél ml-enként 10 mM nátrium-azidot tartalmazó sóoldattal mossuk és abban tartjuk 4 *C-on. A kapcsolás fokát 280 nm-en végzett extinkcióméréssel határozzuk meg és ez 15-30 mg AnCht/ml gél. A kapott AnCht-gélből 4 ml-t alkalmazunk az affinitás-oszlop készítéséhez. Megegyező módon tisztíthatjuk az Na-acetil-eglint, -eglin-C-t és -eglin-B-t is. * 26. példa Alternatív eljárás az N*-acetil-eglin-C tisztítására Az előző tisztítási eljárással alternatív vagy azt kiegészítő módon (vö. 24. és 25. példák) alkalmazhatjuk a következő tisztítási lépéseket: a) Az oldott anyag butanolos extrakciója Az oldás után négyszeres lefagyasztással és felengedéssel elroncsolt sejteket [vö. 24. a) példa] ecetsavval [végkoncentráció0,1%, pH 4,5] elegyítjük. Akicsapódott bakteriális fehérjét centrifugálással választjuk el. Az N°-acetil-eglin-C a felülúszóban marad. Az n-butanol/ecetsav/víz 5:1:4 (25 ml) kétfázisú elegyet erőteljesen előkeverjük. Utána 2 órán át hagyjuk egyensúlyba jutni, mimellett az elegy két fázisra válik szét. 0,5 ml 0,1% ecetsavas oldott anyag mintát (ld. fent) 250 pl alsó fázissal hígítunk és az N-acetil-egün-C-t 750 pl felső fázissal extraháljuk (5 perc Vortex, Fa. Bender Hobein). Ezt kővetőén szobahőmérsékleten 60 perces centrifugálással (5400 ffp) választjuk szét a fázisokat. (Hettich asztali centrifuga EBA 3S). A mintát Fa. Savant készülékkel (Speed Vac Concentrator) nagyvákuumban szárazra pároljuk. Az N°-acetil-eglin-C-t HLE-teszttel, RP-HPLC-vel és SDS-gélelektroforézissel mutatjuk ki. b) Gélszűrés Sephadex G 50-en A kapott anyagból 31 mg-ot 600 pl 30%-os ecetsavban szuszpendálunk, 5 percen át szobahőmérsékleten 5000 ffp-en centrifugáljuk és a tiszta felülúszót Sephadex-oszlopra, G 50 fine (Pharmacia) visszük (az oszlop méretei: 1,5 cm • 30 cm; detektálás: LKB 8300 Uvicord II; 254 nm, transzmisszió 500 mV; áramlás 0,4 ml/perc). 50 ml 2%-os ecetsavval eluálunk. Az N°-acetil-eglin-C-t a 6-8. frakciókban (2,5 ml) kapjuk. Kitermelés: 3 mg tiszta liofilizátum, tisztaság kb. 95%. c) Az bP-acetil-eglin-C és eglin-C anioncserélő kromatográfiája DEAE-cellulózon Az ecetsavas fehérjekicsapás után kapott felülúszóből 100 ml-t [vö. 26. a) példa] töményítünk és DEAE- 53-n (Whatman) pH 6-on anioncserélő kromatográfiának vetjük alá (kromatográfiás körülmények: oszlop, 1,5*80 cm, eluáló puffén 30 mM ammónium-acetát, pH 6,6, áramlás 15 ml/óra, frakciótérfogat 3,5 ml). Az oszlopot eluáló pufferrel egyensúlyba hozzuk és megkezdjük a kromatografálást, míg az első csúcs (eglin-C) a 18-25. frakciók között eluálódik. Az 50. frakciótól egyenként 300 ml eluáló pufferből és 0,06 M ammónium-acetát/0,4 M NaCl-ből (pH 4,5) álló lineáris sógradienst alkalmazunk. Az Na-acetil-eglin-C a 70-85. frakciók között eluálódik. RP-HPLC-vel, PAGE-vel és HLE-teszttel mutatjuk ki. A termék tisztasága kb. 90% a fehérjetartalomra vonatkoztatva. EP (összegyűjtött frakciók 18-25.): 6,5 IP (összegyűjtött frakciók 70-85.): 5,4 27. példa Az N°--acetil-eglin-C szerkezet bizonyítása és fizikaikémiai jellemzése a) Az aminosavösszetétel meghatározása 200 pg N-acetil-eglin-C-t 6 N sósavval 110 *C-on 24 órán át hidrolizálunk és utána S. Moore et al. (29) szerint analizáljuk. A hidrolizátum összetétele a következő: Aminosav Hidrolizátum Aminosav Hidrolizátum Asn 7,2(7) Met 0 (0) Thr 4,6(5) Leu 5,3 (5) Ser 3,5 (3) Tyr 4,9 (6) Gin 7,8(7) Phe 4,9(5) Pro 5,4(6) Lys 2,3 (2) Gly 5,7(5) His 2,5(3) Alá 1,6(1) Trp 0 (0) Val 10,1 (11) Arg 4,5(4) Összes: (70) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 32
