203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 közeg pH-értékét és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy maximális eglin-titert kapjunk. így előnyös valamely E.coli törzset aerob körülmények között süllyesztett kultúrában rázás vagy keverés közben 20- 40 "C hőmérsékleten, előnyösen 30 *C-on, és pH 4-9- en, előnyösen pH 7- en, 4-20 órán át, előnyösen 8-12 órán át tenyészteni. Az expressziós termék (Eglin) intracellulárisan gyűlik össze. Ha a sejtsűrűség megfelelő értéket ért el, a tenyésztést megszakítjuk és a gazdasejtekből az eglint szabaddá tesszük. Ebből a célból a sejteket elroncsoljuk, például detergenses, így SDS-es vagy Triton-os kezeléssel, vagy a sejtfalat lizozimmal vagy hasonló hatású enzimmel oldjuk. Alternatív vagy kiegészítő módon mechanikus erőt, például nyíróerőt (például X-Press, French-press, Dyno-malom), vagy üveggyönggyel vagy alumínium-oxiddal való rázást, vagy váltakozó lefagyasztást, például folyékony nitrogénben és felengedést, például 30-40 ‘C-ra, valamint ultrahangot alkalmazhatunk a sejtek feltárásához. A kapott elegyet, amely fehérjéket, nukleinsavakat és egyéb sejtalkotókat tartalmaz, centrifugálás után önmagában ismert módon fehérjére nézve, beleértve az eglint, töményítjük. így például a nemfehérje-alkotók legnagyobb részét polietilénimines kezeléssel leválasztjuk és a fehérjéket, beleértve az eglint, például az oldat ammónium-szulfátos vagy más sóval történő telítésével kicsapjuk. A bakteriális fehérjék ecetsavas savanyítással (pl. 0,1%, pH 4-5) is kicsaphatók. Az eglin további töményítése az ecetsavas maradék n-butanolos extrakciójával érhető el. További tisztítási lépések például a gélelektroforézis, a kromatográfiás eljárások, például az ioncserélő kromatográfia, a gélkromatográfía, nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia RPHPLC és hasonlók, az elegy komponenseinek molekulanagyság szerinti elválasztása alkalmas Sephadexoszlopon, dialízis, affinitáskromatográfia, például antitest-, különösen monoklonális antitest-affinitáskromatográfia vagy affinitáskromatográfia anhidrokimotripszin-oszlopon, és további, különösen az irodalomból ismert eljárások. Például a kifejeződött eglin izolálása a következő lépésekből áll: A sejtek elválasztása a tápoldatból centrifugálással: Nyerskivonat előállítása a sejtek elroncsolásával, például oldóenzimmel való kezeléssel és/vagy váltakozó lefagyasztással és újrafelengedéssel: Az oldhatatlan alkotórészek lecentrifugálása: A DNS-kicsapás polietiléniminnel: A fehérjék, beleértve az eglint, kicsapása ammónium-szulfáttal: Az oldott csapadék affinitáskromatográfiája monoklonális anti-eglin-antitest-oszlopon vagy anhidrokimotripszin-oszlopon: Az így kapott oldat sómentesítése dialízissel vagy Sephadex G 25 kromatográfiával. Alternatív módon a DNS leválasztása után a bakteriális fehérjéket 0,1%-os ecetsavval kicsaphatjuk, a savas felülúszóból az eglint extrahálhatjuk vagy a savas felülúszót közvetlenül ioncserés kromatográfiának (például karboxi-metil-cellulózon) vethetjük alá. További tisztítási lépésnek számít a Sephadex G 50 (vagy G 75)-tel végzett gélszűrés és a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia. A sómentesítés ismét Sephadex G 25-ön történik. Az eglinaktivitás kimutatására az anti-eglin-antitestekkel (például házinyúlból kapható, vagy hibridomasejtekből kapható monoklonális antitestek) végzett teszt vagy a humán-leukocita-elasztáz (HLE) vagy katepszin G (Cat G) (1) proteázok eglinnel való gátlása használható. Valamely (XIV) általános képlet átalakítása - a képletben r jelentése 0 és az N-terminálison szabad aminocsoport található - a megfelelő (XIV) általános képletű vegyületté különösen enzimatikus úton történik. Például az acetilcsoportot E.coli-ból, házinyúl-retikulocitákból vagy búzacsírákból (8) származó N°-acetil-transzferáz (tiszta formában, alkalmas mikroorganizmus kivonata vagy oldata formájában vagy szervkivonat formájában) segítségével acetil-koenzim-A jelenlétében vihetjük be. A találmány szerint előállítható (XIV) általános képletű vegyületeket önmagában ismert módon más (XIV) általános képletű vegyületekké alakíthatjuk. így a kapott (XIV) általános képletű vegyületben, amely N-terminális aminosavként metionint vagy N- terminális acetilezett aminosavat tartalmaz, a metionint vagy az acetilcsoportot lehasíthatjuk. Például a találmány szerint előállítható N-terminális metionilcsoportot tartalmazó eglinszármazékokat ilyen csoportot nem tartalmazó eglinszármazékokká alakíthatjuk oly módon, hogy a terminális metionilcsoportot a szokásos módon bróm-cianiddal lehasítjuk. A bróm-cianidos reagáltatást például vizes-savas közegben, így híg sósavbanl például 0,1-0,3 N sósavban, vagy erős szerves savban, például 50-70%-os hangyasavban, szobahőmérsékleten vagy kissé emelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például 15-25 *C-on 24 órán át végezzük. Megfelelőén az eljárás szerint kapott, N-terminális acetilezett aminocsoportot tartalmazó (XIV) általános képletű vegyületben az acetilcsoport lehasítható. Az acetilcsoportot, például enzimatikusan hasíthatjuk le, így alkalmas acilázzal, például disznóveséből vagy alkalmas mikroorganizmusokból előállítottal, vagy alkalmas acetiltranszferázzal, koenzim A jelenlétében, mimellett tiszta enzimkészítmények helyett mikroorganizmusok kivonatait vagy lizátumait, ill. szervkivonatokat is alkalmazhatunk, amelyek ilyen enzimeket tartalmaznak (ha N°-acetil-eglin-B-t vagy -C-t termelő törzsként E.coli HB101-et alkalmazunk, akkor például E.coli HB101 lizátumot). A találmány szerint előállított (XIV) általános képletű vegyületek keverékét, például, amely olyan (XIV) általános képletű vegyületekből áll, ahol a képletben V jelentése Thr vagy acetil-Thr, önmagában ismert módon szétválaszthatjuk az egyes komponensekre. Alkalmas elválasztási eljárások, például a kromatográfiás eljárások, például az adszorpciós kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, nagynyomású folyadékkro-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
