203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 A találmány tárgya eljárás az eglinként elnevezett proteáz-inhibitorokat kódoló DNS-szekvenciák, az ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó hibridvektorok az ilyen hibridvektorokkal transzformált gazdasejtek, az ilyen transzformált gazdasejtekkel termelt proteázgátló-hatású új polipeptidek, ezeknek a DNS-szekvenciáknak, hibridvektoroknak és transzformált gazdasejteknek az elállítására és az eglinek transzformált mikroorganizmusok segítségével történd előállítására. A 2 808 396 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratból ismert két, orvosi piócából CHidrudo medicinalis) izolált proteáz-inhibitor, az eglin-B és eglin-C. Ezek a polipeptidek egyenként 70 ami- 5 nosavból épülnek fel, molekulasúlyuk kb. 8100 és erősen gátolják a kimotripszint, szubtilizint, az állati és emberi granulocita-proteáz-elasztázt és katepszin G-t, valamint a hízósejt-proteáz-kimázt (1). Kevésbé gátolják a tripszinhez hasonló proteázokat Az eglin-C primer struktúrája (2) az alábbi: ThrGluPheGly SerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnAlaAigGluTyrPheThrLeuHisTyrProgln’iyrAspValTyrPheLeu ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgiyrAsnArgValArgValPhe TyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly Az eglin-C a legtöbb ismert proteázgátlóval ellentétben nem tartalmaz diszulfidhidat és olyan minifehérjének bizonyul, amely szokatlanul stabil a sav, lúg vagy hő hatására történő denaturálással és a proteolitikus lebontással szemben. Az eglin-B primer struktúrája annyiban különbözik az eglin-C struktúrájától, hogy a 35. pozícióban tirozin helyett hisztidint tartalmaz. A humán és állati eredetű granulocita-elasztázok, valamint a humán granulocita-katepszin G és a szubtilizin típusú bakteriális proteázok ma ismert legerősebb inhibitorai az eglinek. A szervezetben ezeknek a proteázoknak szabályozatlan, ill. feleslegben való képződése gyulladási folyamatot fokozhat és nemspecifikus proteolízissel szövetlebomlást idézhet elő. Ez különösen azért lehetséges, mert hatásuk az intracelluláris emésztésben résztvevő enzimekre fiziológiás (semlegestől enyhén alkálikusig) környezetben optimális és az eredeti szövetalkotókat (pl elasztin) és humoralis faktorokat (pl. véralvadási és kiegészítő faktorok) gyorsan elbontják és maktiválják. Az eddig megismert tulajdonságok alapján az eglinek alkalmazása az orvosi terápiában (gyulladást gátló szerek, gyulladást csökkentő szerek, szeptikus sokk, tüdőtágulás, mucoviscidosis stb.) nagy érdeklődésre tarthat számot. Az orvosi piócában csak nagyon kis mennyiségben (kb. 16 pg/pióca) képződnek eglinek. Az eglinek izolálása és tisztítása orvosi piócából ezért nagyon időigényes és költséges és kereskedelmi méretekben nem kivihető. Az úgynevezett rekombináns DNS-technológia (vagy géntechnológia) rohamos fejlődése lehetővé teszi különböző élettanilag aktív polipeptidek előállítását ezzel a technológiával. A találmány célja, hogy géntechnológiai eszközök segítségével olyan expressziós rendszert bocsásson rendelkezésre, ami az eglinek mikrobiális előállítását ipari méretben lehetővé teszi. Ezt a feladatot a találmány eglingént tartalmazó hibridvektorok elkészítésével oldja meg, amit azután egy expressziós kontroliszekvencia oly módon szabályoz, hogy a hibridvektorokkal transzformált gazdában az eglingén kifejeződik. Eg lint kódoló DNS-szekvenciák előállítása A találmány az eglint, pl. az eglin-B-t és különösen az eglin-C- t, vagy módosított eglint, pl. módosított eglin-B-t vagy különösen módosított eglin-C-t, mimellett a módosítás lényegében az eglin primer struktúrájának megrövidítését jelenti az eglinaktivitás megőrzése mellett - kódoló DNS-szekvenciákra és ezek fragmentumaira vonatkozik. A találmány keretében „eglin” általános elnevezés alatt, ha külön nincs definiálva, olyan proteinázgátlóhatású polipeptideket értünk, amelyek primer struktúrája messzemenő (általában 80%-ig terjedő struktúrhomológia) azonosságot mutat az eglin-B vagy -C primer struktúrájával, az N-teiminális azonban módosított, például a treoninon Na-acetilezett, Na-metionilezett vagy Na-acetil-metionilezett is lehet. Az eglinek módosítása előnyösen a természetes eglinek primer struktúrájának az N-terminálison például 1-10, különösen 1-6 aminosavval és/vagy a C-terminálison 1-6, különösen 2 aminosavval való megrövidítését jelenti, mimellett itt is beleértendők az N-terminálison módosított, például acetilezett és metionilezett vagy N-acetil-metionilezett származékok. A találmány továbbá eljárás az eglint, például az eglin-B-t vagy különösen az eglin-C-t, vagy módosított eglint, például módosított eglin-B-t vagy különösen módosított eglin-C-t kódoló DNS-szekvenciák és azok fragmentjeinek előállítására azzal jellemezve, hogy a piócagenomból izoláljuk az eglin-struktúrgént, vagy az eglin-m-RNS-ről komplementer kettős szálú DNS-t (eglin-ds cDNS) készítünk, és a módosított eglint kódoló DNS-szekvenciák előállításához az eglin-struktúrgént vagy az eglin-cDNS-t megfelelő nukleázokkal kezeljük, vagy a megfelelő (módosított) eglin-struktúrgént vagy annak fragmentjeit kémiai és enzimatikus eljárásokkal állítjuk elő. Az eglin-DNS-t és az eglin-cDNS-t például önmagában ismert módszerekkel kapjuk. így az eglingént piócagénbankból kapjuk, oly módon, hogy a pióca- DNS-fragmentumokat mikroorganizmusban klónozzuk és az eglin-DNS-t tartalmazó kiónokat, például kolónia- hibridizálással azonosítjuk, amihez olyan radioaktív jelzett eglin-DNS specifikus oligodezoxinukleotidot alkalmazunk, amely legalább 15, előnyösen 15-30 dezoxinukleotidot tartalmaz. Az így kapott DNS-fragmentumok az eglingén mellett rendszerint még további nemkívánatos DNS-szakaszokat tartalmaznak, amiket 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
