203781. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fertőző bursitis elleni inaktivált vakcina előállítására
1 HU 203 781 B 2 Mérési adatainkat táblázatba foglaltuk. 2.hét 4. hét 6. hét 8. hét 20. hét inakt. vakcina 2,9 3,56 3,75 3,95 3,65 élő vakcina 3,25 3,75 3,95 4,08 3,20 (az értékek 10 lg-ben) Az állomány felszámolása előtt gyűjtött tojásból keltetett naposcsibéket vadvírussal fertőztük, csoportonként 100-100 csibét. Az inaktivált vakcinával oltott tojókból származó csibék elegendő szikimmunitással rendelkeztek, mert a csibék 100%-ban védettek maradtak a ráfertőzéssel szemben. Az élővírusos vakcinával immunizált tojókból számlázó csibék 60%-a maradt védett a ráfertőzés után. Az inaktivált vakcinát adjuváló olaj elnyújtottabbá teszi az immunizáló hatást A találmányunk szerint előállított inaktivált vakcinát ismert inaktivált vakcinával, az amerikai Vineland cég vakcinájával is összehasonlítottuk. 20 ezer előimmunizált növendék csirke került oltásra. A vírusneutralizációs vizsgálat szerint a savó átlagos neutralizációs there oltás előtt 767 (reciprok) volt. Hat héttel az oltás után: a találmány szerinti vakcinával 2979 Vineland vakcinával 2307 volt. Látható, hogy a találmány szerinti vakcinával jobb értéket kapunk. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről: 1. példa 10-11 napos SPF előkeltetett tyúktojás embrióinak 0,07-0,08%-os tripszines emésztésével szövettenyészetet készítünk. A sejtek szaporítását 10% TPB-t, 4- 6% borjúsavót tartalmazó MEM-H tápfolyadékban végezzük. A Roux vagy rolling palackon 24-48 óra alatt benőtt sejtkultúrát 100-1000 TCIDx/0,1 ml titerű GP/82 vírus 10 ml-jével oltjuk be. Egy óra adszorbeáltatás után 200 ml 10% TPB (triptóz-foszfát leves)-t és 2% borjúsavót tartalmazó MEM-E fenntartó oldattal a palackokat feltöltjük. A palackokat 37 ‘C-on tartjuk. 3-5 nap alatt a vírus sejtkárosító hatása teljessé válik, ekkor a felülúszókat összeöntjük. A steril és legalább 106 TCKWO.l ml vírust tartalmazó vírusszuszpenziót alapos összerázással homogenizáljuk, majd 37 °C-on, 24 órán keresztül etilén-imin 0,8 t%-os vizes oldatával inaktiváljuk. Az etilén-imin koncentrációja a kész vakcinában 2000 pg/ml. A felesleges inaktiválószert 50%-os nátrium-tioszulfát-oldattal, a folyamat során keletkezett lúgot pedig glicin- HCl-es pufferrel semlegesítjük. Az inaktiválás befejezésével csirkeembrió fibroblaszt szövettenyészetre oltással meggyőződünk a tökéletes inaktiválásról, és az inaktivált vírust tartalmazó anyagot további feldolgozásig +4 "C-on tároljuk. Az inaktivált és steril antigént azonos mennyiségben inkomplett olajadjuvánssal (Atlas cég gyártmánya) keverjük és homogenizáljuk. A kapott vakcinát +4 ‘C-on tároljuk. Az oltóanyag egy évig tárolható. 2. példa Az 1. példában leírt módon előállított vírusszuszpenziót 1000 pg/ml formaldehiddel 24 órán keresztül, 37 ‘C-on történő kezeléssel inaktiváljuk. Az inaktivált és steril antigént azonos mennyiségű inkomplett olajadjuvánssal összekeverjük és homogenizáljuk. A kapott vakcinát +4 ”C-on károsodás nélkül egy évig tárolhatjuk. 3. példa Az 1. példában leírt módon előállított vírusszuszpenziót 3000 pg/ml béta-propiolaktonnal 24 órán keresztül, 37 ‘C- on történő kezeléssel inaktiváljuk. Az inaktivált és steril antigént azonos mennyiségű 2 t%-os alumínium-hidroxid-géllel alaposan összekeveijük. A vakcinát +4 ‘C-on károsodás nélkül egy évig tárolhatjuk. A példában alkalmazott rövidítések: SPF: specifikus kórokozóktól mentes állományból származó csirke, TPB: triptóz-foszfát leves, MEM-H:1 Mininal Essential Medium-Hanks, MEM-E:2 Minimal Essential Medium-Earle, TCID50: Tissue culture infective dose, szövetkultúrát 50%-ban fertőző dózis 1 összetételét lásd a: Hanks, H., Wallace, R. E. Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 71, 196 (1943) Eagle, H.: Science 130, 433 (1959) irodalmi helyen. 2 összetételét lásd a: Earle, W. R.: J. Natl. Cancer Inst. 4, 165 (1943) Eagle, H.: Science 130, 433 (1959) irodalmi helyen. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás fertőző bursitis elleni inaktivált vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a GP/82 jelű, NCAIM V(P) 001 033 számon letétbe helyezett bursitis vírustörzset csirkeembrió fibroblaszt sejttenyészeten szaporítunk, a maximális vírustiter elérésekor a vírusfolyadékot összegyűjtjük, a vírust inaktiváljuk, majd adjuvánssal keverjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inaktiválást formaldehiddel, etilén-iminnel vagy béta- propiolaktonnal végezzük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként olajos vagy alumíniumhidroxid-gél adjuvánst alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3
