203780. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fertőző bursitis elleni élő liofilizált vakcina előállítására
1 HU 203 780 B 2 Példa 10-11 napos SPF előkelte tett tyúktojás embrióinak 0,07-0,09%-os tripszines emésztésével szövettenyészetet készítünk. A sejtek szaporítását 10% TPB (triptóz-foszfát leves)-t, 4% boíjúsavót tartalmazó MEM-H tápfolyadékban végezzük. A palackokban 24-48 órára benőtt sejtkultúrát 100-1000 TCIIVO.l ml LIBDV/82 jelű vírus 10 ml-ével oltjuk be. Egy óra adszorbeáltatás után 10% TPB-t, 2% borjúsavót tartalmazó MEM-E fenntartó oldattal a palackokat feltöltjük. A palackokat 37 *C- on tartjuk. 3-5 nap alatt a vírus sejtkárosító hatása teljessé válik, ekkor a felülúszókat összeöntjük. A steril és legalább 106 TCID50/0,1 ml titerű anyagot a további felhasználásig fagyasztva tároljuk, majd 50% arányban steril, sovány (fölözött) tejet keverünk hozzá. Az anyagot 2 ml-enként 10 ml-es liofilizáló üvegekbe töltjük és liofilizáljuk. A vakcina a kipróbálástól számított egy éven belül használható fel. 2 ml vakcina 500-1000 csibéhez elegendő. 3 hetesnél idősebb csibéknek adjuk. A példában alkalmazott rövidítések: SPF: specifikus kórokozóktól mentes állományból származó csirke, TPB: triptóz-foszfát leves, MEM-H:1 Minimal Essential Medium-Hanks, MEM-H:2 Minimal Essential Medium-Earle, TCID^: Tissue culture infenctive dose, a szövetkultúrát 50%-ban fertőző dózis 1 összetételét lásd a Hanks, H., Wallace, R. E, Proc. Soc, Exp. Biol. Med, 71,196 (1943) Eagle, H.: Science 130,433 (1959) irodalmi helyen. 2 összetételét lásd az Earle, W. R.: J. Natl. Cancer Inst. 4,165 (1943), Earle, H.: Science 130, 433 (1959) irodalmi helyen. A találmány szerint előállított vakcina hatékonyságát részben az immunizálást követő szerológiai áthangolódás (agargélprecipitációs-, vírusneutralizációs próba) meghatározásával, részben az immunizálást követően különböző időpontban történt vadvírus ráfertőzéssel szembeni védettség mértékében mértük. Egynapos és háromhetes SPF (Specific Pathogen Free) csirkéket vizsgáltunk. Egy-egy csoportban 50 állatot immunizáltunk. Az immunizálást követő második naptól kétnaponként 5-5 állatot vadvírussal ráfertőztünk, illetve 5-5 állatot elvéreztettünk szerológiai vizsgálatok céljára. Megállapítható volt, hogy a napos korban történt vakcinázás után a 8. naptól alakult ki számottevő védettség, amely a 10. napon már 100%-os volt Ugyanezekben az időpontokban tudtunk először kimutatni ellenanyagokat is a vérben. 3 hetes korú állatok immunizálása esetén már a vakcinázás utáni 4. naptól teljes védettség alakult ki. A törzs esetleges meglévő reziduális (maradék) patogenitásának és ártalmatlanságának meghatározása céljából 1 napos és 3-4 hetes csirkéket fertőztünk szájon át 105 TCIE>50/O,2 ml vírussal. Összehasonlítás céljából egy csoport csibét vadvírussal fertőztünk. Kontrollként hasonló korú és létszámú fertőzetlent vizsgáltunk. Egy-egy csoportban 30-30 állatot fertőztünk. A fertőzést követően figyeltük az esetlegesen észlelhető klinikai tüneteket, majd az 5., 10. és 22. napon valamennyi csoportból 10-10 állatot leöltünk. Elvégeztük valamennyi állat kloakális bursá-jának kórszövettani vizsgálatát. Megállapítható volt, hogy egyetlen vakcinázott csoportban sem jelentkezett megbetegedés vagy elhullás. Kórszövettani vizsgálattal megállapítható volt, hogy a vakcinázás utáni 5. napon enyhének minősíthető elváltozásokat észleltünk: mérsékelt lymphoid necrosist és a lymphoid sejtek részleges kiürülését. Vérzést, ödémát, gyulladást vagy kifejezettebb necrosist sohasem találtunk, Ezek a kezdeti elváltozások a későbbi (10. és 22. nap) vizsgálatoknál nyomtalanul regenerálódtak. Megállapítható tehát, hogy az előállított vakcinának nincs bursa Fabricii károsító hatása. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás fertőző bursitis elleni élő liofilizált vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a LIBDC/82 jelű, NCAIM V(P) 001 034 számon letétbe helyezett fertőző bursitis vírustörzset csirkeembrió fibroblaszt sejttenyészeten szaporítunk, a maximális vírustiter elérésekor a vírusfolyadékot összegyűjtjük, majd védőkolloid alkalmazásával liofilizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy védőkolloidként sovány tejet alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3
