203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 HU 203 675 B 2 szerűen és szelektíven kinyertük, és eközben a felületaktív anyaghoz (detergenshez) való kapcsolódását is megszüntettük. Az itt leírt hatás kiváltásához előnyös, ha az alkalmazott polietüénglikol átlagos móltömege 5500- 6500 dalton között van, értéke előnyösen pedig 6000 dalton. A csapadékképződés szempontjából kedvező, ha a polietüénglikol adagolása után az oldatot mindkét esetben +2 #C és +8 °C hőmérsékleten, 10-20 óráig állni hagyjuk. Az alacsony hőmérséklet a fehérjék esetleges bomlásának megakadályozása miatt szükséges. A csapadék kiválasztásának legegyszerűbb módja, ha azt a polietüénglikol adagolását követően alacsony fordulaton végzett centrifugálással távolítjuk, ületve különítjük el. Az „alacsony fordulat” jeUegzetesen 2000-3000 fordVperc sebességet jelöl, amely normál laboratóriumi centrifugával megvalósítható. Az értékes anyagot tartalmazó csapadékból a detergens tökéletesebb eltávolítása érdekében a második polietüénglikol adagolást követően elkülönített csapadékot 5-10 tömegszázalék mennyiségű polietilénglikolt tartalmazó pH 6-8 foszfátpuff eres sóoldatban ultrahangos keverés közben mossuk, majd a csapadékot 2000-3000 fordVperc fordulatszámon végzett centrifugálással különítjük el. A csapadék reszuszpendálását célszerű pH 6-8 foszfátpufferes sóoldatban ultrahangos kezeléssel együtt végezni. A sóoldat célszerűen 0,9 vegyesszázalék nátrium-klorid tartalmú. Tökéletesebb tisztítást érhetünk el, ha a reszuszpendálást és a csapadéknak az azt követő alacsony fordulaton végzett centrifugálással történő elkülönítését több alkalommal megismételjük. Az így előállított alegység vakcina hatóanyagból Aujeszky-féle betegség eüeni vakcinát áüíthatunk elő, ha a hatóanyagot közvetlenül vagy adott esetben további tisztítás vagy formulázás után olajos adjuvánssal, például inkomplett Freund adjuváns olajjal összekeverjük. Abból a célból, hogy a protektiv antigén hatóanyagból protein-miceüát vagy viroszómát állítsunk elő, azt 0,7-1,5 térfogatszázalék detergens, előnyösen oktilfenü-polietüénglikol-éter adagolásával oldatba visszük, és a visszamaradó csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A viroszómák előállítása érdekében a detergenssel szolubilizált oldathoz, tehát a glikoproteinekhez a csapadék eltávolítása után lipid oldatot adagolunk. Ennél a lépésnél előnyös, ha a lipid koncentráció 0,5 g lipid/ml körül van, és a lipidet különböző típusú lipidek keveréke képezi, például tojáslecitin és koleszterin 7:3 arányú keveréke. A detergens eltávolítása és a megfelelő formájú micellák kialakítása érdekében a detergenssel kezelt oldatot hidrofób affinitásé adszorbens gyantával érintkeztetjük, és az érintkeztetés után eltávolított oldatot keverjük össze az olajos adjuvánssal. A detergens szelektív és gazdaságos megkötéséhez célszerű, ha az adszorbens gyantát semleges sztirol-divinil-benzol kopolimer adszorbens gyanta, előnyösen porózus állagú gyanta képezi. Az eljárás eddig ismertetett összes foganatosítási módja során az első detergens kezelést követően egyszerű és hatékony tisztítást végezhetünk azáltal, hogy a szolubüizálást követően alacsony fordulaton (2000- 3000 fordVperc) végzett centrifugálással az oldatban lévő különböző benne oldhatatlan törmelékeket eltávolítjuk. A találmány szerinti eljárás különböző változatait és foganatosítási módjait a továbbiakban példák kapcsán ismertetjük részletesebben. 1. példa Alegység vakcina hatóanyag előállítása Az alegység vakcina hatóanyag előáüításához az Aujeszky-féle betegség klinikai tüneteit mutató sertés tüdejéből, szövettenyészetben izoláltuk a vírus egy helyi törzsét. A vírustörzs azonosítása immunfluoreszcenciával, vírussemlegesítési próbával és DNS restrikciós enzimes analízissel történt. Az elszaporítás a Szentgyörgyi Albert Orvostudományi Egyetemen tárolt törzsből származó VERŐ sejtvonalon (afrikai zöld majom veséjéből származó sejtvonal) történt. Az elszaporítás során egy 5 liter térfogatú, kb. 1000 cm3 felületű hengeres üveg tenyésztőedény belső felületéről a sejteket általánosan elfogadott körülmények mellett végzett tripszines emésztéssel választottuk le. A kezelés 15 percig tartott. Az emésztő hatást 10 térf% fötális borjúsavó hozzáadásával állítottuk le, hogy a tripszinnek az életképes sejtekre gyakorolt további káros hatását meggátoljuk. Az így nyert sejtszuszpenziót 2000 fordVperc sebességgel végzett centrifugálással szabadítottuk meg az enzimet tartalmazó felülúszótól. A VERŐ sejteket tartalmazó üledéket először kb. 100 ml 10% kolosztrummentes borjúsavót tartalmazó, Dulbecco által módosított összetételű Eagle-féle minimál (esszenciális) tápfolyadékban pipettával való felszívással és erélyes kifújással eloszlattuk (reszuszpendáltuk). A sejtszuszpenziót 10% fötális borjúsavót tartalmazó, a fentihez hasonló tápfolyadékkal 1000 ml-re hígítottuk, majd öt hengeres tenyésztőedénybe osztottuk szét. A tenyésztőedények a hivatkozott ötliteres edénnyel azonosak voltak. Az edényeket 1 fordVperc sebességgel 37 °C hőmérsékleten 72 órán keresztül lassan forgattuk, és ezen inkubáció eredményeként a falon összefüggő sejtréteg alakult ki. A következő lépésben az edényekből az elhasznált tápfolyadékot kiöntöttük, a sejtszőnyeget kb. 100 ml savómentes tápfolyadékkal forgatás közben mostuk, majd kb. 10-es multiplicitással fertőztük a korábban elszaporított vírussal. A10-es multiplicitás azt jelenti, hogy egy sejtre a fertőzés során átlagosan 10 vírus jut. A 30 perces vírusadszorpciót követően a tenyészeteket 100 ml tápfolyadékkal mostuk, majd 100 ml/edény savómentes tápfolyadékkal az edényeket 37 °C hőmérsékleten további 16 órán keresztül forgattuk. Ezen idő elteltével az egészséges sej trétegre jellemző mikroszkó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
