203672. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Mycoplasma hyopneumoniae antigéneket tartalmazó vakcina előállítására
1 HU 203 672 B 2 és/vagy fragmentumaikat olyan mennyiségben alkalmazzuk a vakcinában, amely hatásos védelmet nyújt mikoplazmás tüdőgyulladás ellen. Általában a vakcina legalább 5 mikrogramm/adag, előnyösen legalább 100 mikrogramm/adag ilyen antigént vagy üyen antigén fragmentumot tartalmaz. Legtöbb esetben a vakcina nem tartalmaz az Uyen antigénekből és/vagy fragmentumokból többet, mint 20 milligram. Ha többszörös adagot alkalmazunk, a vakcinát általában nem adjuk be olyan mennyiségben, amely háromadagnyi mennyiséget meghalad, nyolc héten át. A „védelem” vagy „védeni” kifejezések, ahogyan itt alkalmazzuk az itt leírt, mikoplazmás tüdőgyulladás elleni vakcinával kapcsolatban, azt jelentik, hogy a vakcina megakadályozza a mikoplazmás tüdőgyulladás kialakulását és/vagy csökkenti a mikoplazmás tüdőgyulladás súlyosságát. A hordozó, amelyet a fehérje jellegű antigénnel vagy fragmentumokkal együtt alkalmazunk, lehet a széles körben alkalmazott hordozók bármelyike. Megfelelő hordozóra reprezentatív példaként megemlíthetjük az alábbiakat: ásványolaj, alumínium-vegyületek, szintetikus polimerek stb. A vakcinákhoz alkalmas hordozók jól ismertek a szakterületen, és a megfelelő hordozó kiválasztása véleményünk szerint az itt leírt kitanítás alapján a szakterületen való jártasság keretein belül van. A megfelelő hordozó kiválasztása függ attól a módtól, ahogy a vakcinát be kívánjuk adni. A vakcina elkészíthető injektálható adagok formájában, és így be lehet adni intramuszkulárisan, intravénásán vagy szubkután. Lehet orálisan is beadni a vakcinát, az aktív komponenseket tápanyaggal vagy vízzel összekeverve, tabletta-formában kiszerelve stb. A vakcina beadásának más módjai az itt leírt kitanítás alapján nyilvánvalóak a szakember számára, következésképpen a találmány oltalmi köre nem korlátozódik egy adott kiszerelési formára. A vakcinát általában állatokra és nem emberekre alkalmazzuk, olyanokra, amelyek fogékonyak a mikoplazmás tüdőgyulladásra, főleg sertésre és szarvasmarhára. A találmány további részletei az alábbi példákban vannak leírva; a találmány oltalmi körét azonban ezek nem korlátozzák. 1. példa A felületi fehérjék extrahálása Mycoplasma hyopneumoniae-t növesztünk a kereskedelemben kapható Friis tápközegben [Nord. Veterinärmed. 27,337-9 (1975)], mintegy 109-1010 színváltási egység (ccu) ml sűrűségig. A sejteket centrifugálással kinyerjük és négyszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal. A sejteket 10 mmól/1 triszt és 10 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban lizáljuk ismételt fagyasztás-felengedtetés ciklusokban, amelyekben a sejteket váltakozva visszük át szárazjeges etanolos fürdőbe és 37 ®C hőmérsékletű fürdőbe, állandó keverés közben. Az oldhatatlan komponenseket és a nem lizált sejteket nagy sebességű centrifugálással távolítjuk el. A szuszpenzióban maradt membránokat ultranagy sebességű centrifugálással (33 000 g 45 percen át) nyerjük ki, foszfáttal puff erőit fiziológiás sóoldattal mossuk, és Triton X-100-foszfáttal puff erőit fiziológiás sóoldattal szolubilizáljuk. Ennél a pontnál a Tritonban oldható és Tritonban nem oldható komponenseket ultra-nagy sebességű centrifugálással (100000 g 45 percen át) elkülöníthetjük. A Tritonban oldható frakció több azonos fehérjét tartalmaz, mint a Tritonban nem oldható frakció. (A Triton X-100 összetétele: nem ionos oktü-fenoxi-polietoxi-etanol felületaktív anyag.) A fajlagos védő antigéneket az oldhatatlan frakcióban közvetett, enzimmel kapcsolt immun-assay-val azonosítjuk. A Mycoplasma hyopneumoniae fehérjéit, amelyek a védő frakciót alkotják, SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elkülönítjük és nitrocellulóz lemezekre visszük át foltképzéssel. A felgyógyuló sertésekből kapott szérumokat ezután inkubál juk a nitrocellulóz lemezekkel, és az immunreaktiv fehérjéket a sertés antitestek ellen készített, biotinilezett kecske antiszérumok felismerik. A felismert antigéneket egy ezt követő reakcióval azonosítjuk avidin-biotin peroxidáz konjugátummal, amely színreakciót ad a kötött fehérjével. Az immunreaktiv fehérjéket, amelyek a védő frakciót alkotják, SDS-12% poliakrilamid gélelektroforézissel mért hozzávetőleges molekulatömegükkel jellemezzük. Ezek az alábbiakat foglalják magukban: 22,5; egy vagy több 34; egy vagy több 36; 41; 44; 48; 52; 64; 68; 74,5; 79; 88,5; 96,5 és 125 kilo-daltonos komponensek. A 41 kDa-s komponens az alábbi aminosav szekvenciával rendelkezik az amino-terminálison: 1 Met-Asp-Lys-Phe-Arg-Tyr-Val-Lys-Pro-Gly-Glu-Ile-Met-Ala-Lys-Asp-Glu-Glu-Met-He A 48 kDa-s komponens az alábbi aminosav szekvenciával rendelkezik az amino-terminálison; 1 Ala-Val-Cys-Lys-Thr-Ile-Gly-Lys-Lys-Cys-Phe A 74,5 kDa-os komponens az alábbi aminosav szekvenciával rendelkezik az amino-terminálison: 1 Ala-Lys-Glu-Leu-Gln-Leu-Gly-Ile-Asp-Leu-Gly-Thr-Val-Asn-Tyr 2. példa Vakcinát állítunk elő olyan módon, hogy alikvotokat készítünk az 1. példában kapott oldhatatlan frakciókból, két 1,7 ml-es adagot és négy 2,0 ml adagot állítva elő, és mindegyik alikvotot azonos térfogatú ásványolaj adjuvánssal homogenizáljuk közvetlenül felhasználás előtt. A vakcinát sertéseknek adjuk be szubkután az alábbi módon: 1,7 ml-es alikvot vakcinát adunk be héthetes korban, és 2,0 ml-es alikvot vakcinát mint emlékeztető oltást adunk be két héttel és nyolc héttel a kezdeti injekció után. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
