203670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bázisosan módosított inzulinszármazékokat és cinkionokat tartalmazó, diabetes mellitus gyógykezelésére alkalmas készítmény előállítására
1 HU 203 970 B 2 céljára a vegyület dózisformája például oldat, öblítővíz, balzsam, krém és gél lehet A találmány szerinti vegyiiletek interleukin-1 bioszintézist gátló képességét a következő próba segítségével mutatjuk ki. C3H/HeN egereket (Charles River, Wilmington, Massachusetts) a nyakcsigolya meghúzása útján megölünk és hasukra 70% etanolt poriasztunk, hogy az elvégzendő sejtpreparálás során elkerüljük a baktériumos fertőzést. Minden egér hasüregébe 5% fötális boíjúszérumot (FCS), penicillin-sztreptomicint [100 E/ml - 100 (tg/01!] és glutamint (2 mM) tartalmazó 8 ml RPMI-1640 médiumot (Hazelton Research Products, Inc., Lenaxa, Kansas) fecskendezünk be. [Olyan fötális borjúszérumot használunk, amely megfelelő érzékenységgel rendelkezik IL-1 iránt a timocita próbában (Hycloue Laboratories, Logan, Utah) és kisfoki! proliferáció következik be IL-1 távollétében.] A sejtek felszabadulásának elősegítése céljából a hashártyát megnyomkodjuk. Ezután a has bőrén bemetszést ejtve feltáijuk az alatta fekvő izomréteget. A hasim folyadékot 20-as méretű injekcióstűvel leszívjuk, a tűt az izomrétegen át rézsútosan szúrva be a mellcsont alá. Hat egér hasűri folyadékát kúpos műanyagcsőben egyesítjük és mikroszkóposán megvizsgáljuk a baktériumos szennyezettséget A nem szennyezett folyadékot mintegy 600 x g-vel 6 percig centrifugáljuk és a feliilúszót leöntjük. Hat cső leülepített sejtjeit egyesítjük és 20 ml RPMI-FCS közegben újraszuszpendáljuk. A sejtszámot hemacitométer segítségével határozzuk meg és a sejtek életképességét tripánkék festéssel ugyancsak hemacitométerben állapítjuk meg. Ezután RPMI-FCS médiummal a sejtszuszpenziót olyan mértékben hígítjuk, hogy sűrűsége 3xl06 sejt/ml legyen. 35 mm-es lemez mélyedéseibe 1-1 ml fenti sejtszuszpenziót mérünk be. A sejteket 2 órán át 37 °C-on CO, atmoszférában inkubáljuk, hogy a makrofágok a mélyedések falához tapadjanak. A felületúszót a lemezek élénk mozgatása útján dekantáljuk. A letapadt sejteket (azaz a makrofágokat) kétszer RPMI-SF médiummal [penicillin-sztreptomicint (100 E - 100pg/ml) és glutamint (2 mM) tartalmazó RPMI] mossuk. A letapadt sejteket tartalmazó mélyedésekhez 1 ml vizsgálandó vegyületet adunk 0,1-100 pg/ml koncentrációtartományban, RPMI-SF médiumban oldva. Kontrollként 1 ml RPMI-SF médium szolgál. Ezután minden mélyedéshez RPMI-SF közegben oldott 100 ml LPS-t [1 mg/5 ml] adunk (LPS: Salmonella minnesota-ból kivont tisztított lipopoli-szacharid, amellyel szemben a C3H/HeJ egér érzéketlen.) A lemezeket 37 °C-on 24 órán át 5% C02 atmoszférában inkubáljuk. A felülúszókat eltávolítjuk és azonnal meghatározzuk IL-1 tartalmukat, vagy lefagyasztva tároljuk későbbi meghatározásig. Az IL-1 vizsgálathoz 6-8 C3H/HeJ egeret (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) a nyakcsigolya meghúzása útján megölünk és timuszukat (csecsemőmirigy) aszeptikus körülmények között eltávolítjuk. A timuszokat négyszer váltott médiummal mossuk [„Eagle's minimum essential medium" Earle-sókkal, amely 6% fötális borjúszénimot, 100 E/ml-100 pg/ml penicillin-sztreptomocint, 2 mM glutamint, 0,1 M nem-esszenciális aminosavat (M. A. Bioproducts, Rockville, Maryland) és 1 mM nátrium-piruvátot tartalmaz], A timuszokat szétdörzsöljük és a kapott sejtszuszpenziót 12 rétegű steril gézen (Johnson + Johnson Products, Inc., New Bninswick, New Jersey) átszűrjük. Szűrés után a sejtszuszpenziót 6 percig 601 x g-vel centrifugáljuk, a felülúszót leöntjük és a sejtüledéket 25 ml fenti Eagle’s médiummal mossuk. A sejtsűrűséget hemacitométer segítségével határozzuk meg és az élő sejtek számát tripánkék festés után szintén hemacitométerben számoljuk meg. Hígítással 2xl07 sejt/ml sűrűségű szuszpenziót készítünk. A fentiek szerint kapott, LPS-stimulált felülúszóból felező sorozathígítást állítunk elő 96 mélyedést tartalmazó mikroüter lemezeken, hígítóként a fent leírt Eagle’s médiumot használva (50 pl felülúszó: 50 pl médium mélyedésenként). Minden mélyedéshez 50 pl 4xl0'5 M 2-merkaptoetanolt adunk. Eagle’s médiummal készült törzsoldatból 50 pl fitohemaglutinin P-t (PHA) (Sigma Chemical. L-9132) adagolunk, hogy a PHA végkoncentrációja 12 mg/ml legyen. Ezután a fentiek szerint előállított timocita szuszpenzióból 50 pl-t adunk a mélyedésekhez, úgyhogy a végső sejtkoncentráció 5xl06 sejt/ml lesz. A lemezeket 37 °C-on 5% C02 atmoszférában 54 órán át inkubáljuk. Ezután minden mélyedéshez Piciált timidint (l,48xl04 Bq aktivitás 10 pl Eagle's médiumban) adunk és a lemezeket a fentiek szerint további 18 órán át inkubáljuk. Inkubálás után a sejteket „sejtgyűjtő” készüléken (Otto Hiller, Madison, Wisconsin) összegyűjtjük és a Whatman üvegrostszűrőkön fennmaradt pelleteket (Whatman, Clifton, New Jersey) megszáritjuk. A pelletek radioaktivitását szcintillációs béta-számláló segítségével toluol/omnifluor szcintillációs elegyben határozzuk meg. A jelen levő IL-1 mennyisége arányos a pelletekbe beépült triciált timidin mennyiségével. A fenti timocita próbán kívül a felülúszók IL-1 tartalmát mennyiségileg az alábbi receptorkötési próbával határozzuk meg. Standard görbét veszünk fel a következőképpen: EL4-6.1 egéreredetű timómasejteket [10— löxlO6 sejt 0,4 ml kötőpufferben (RPMI 1640, 5% FCS, 25 mM HEPES, 0,01% NaN3, pH 7,3)] adunk változó mennyiségű jelzetlen egéreredetű rIL-la-hoz [Escherichia coli-bm létrehozott rekombináns IL-1 a, melynek aminosav szekvenciája megfelel az IL-la-ra közölt, 115-270 közötti szakasz aminosav szekvenciájának (Lomedico P. M. és munkatársai, Nature 312, 458-462 (1984)] (40 pg - 40 ng IL-la 0,5 ml pufferben) és 1 órán át 4 °C-on folyamatos rázás közben inkubáljuk, majd 0,8 ng (0,1 ml) humán 125J-rIL-lß-t (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) adunk hozzá és a rázást további 3 órán át folytatjuk. A mintákat Yeda készülék segítségével szűrjük (Linca Co., Tel-Aviv, Izrael) Whatman GF/C2.4 cm üvegrost szűrőkön (0,5% poralakú tejjel 2 órán át 37 °C-on blokkolva) és egyszer 3 ml jéghideg pufferrel mossuk. A szűrők radioaktivitását Searle gamma-számlálóban mérjük le és nem-specifikus kötődésnek a 200 ng jel-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
