203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B gét alapul tekintve kevesebb, mint 5 tömeg%-ban vannak jelen, és általában összmennyiségben legfeljebb mintegy 0,001 tömeg%-ban vannak jelen ugyancsak az antitest-koncentrációt véve alapul. Gyakran kívánatos, hogy a készítmény közömbös töltőanyagot vagy kötőanyagot is tartalmazzon, hogy hígítsa az aktív alkotórészeket, ahol a töltőanyag a teljes kompozícióra számítva 1-99 tömeg%-ban lehet jelen. Ahol egy második antitestet alkalmazunk, amely képes a monoklonális antitest kötésére, ez az antitest általában külön fiolában van jelen. A második antitest tipikusan jelzéshez van kötve, és hasonló módon van kiszerelve, mint a fentebb leírt antitest-kiszerelések. A következő kísérleti adatokat és információkat példaként nyújtjuk, és nem korlátozás céljából. I. példa Ez a példa módszert mutat be olyan humán monoklonális antitest előállítására, amely nemzetségek közti kereszt-reaktivitással rendelkezik az Escherichia coli (E. coli), Serratia marcescens (S. marcescens), Klebsiella pneumoniae (K. pnaumoniae) és Enterobacter aerogenes (E. aerogenes) nemzetségek tagjai ellen. A példa továbbá bemutatja az említett antitest in vivo védő aktivitását a homológ (kereszt-reagáló) E. coli és E. aerogenes szerotípusok halálos kihívása ellen. A. Megfelelő humán sejtek nyerése Megfelelő humán B sejteket (limfocitákat) kapunk olyan egyén perifériás véréből, akiről ismert, hogy cisztás fibrózis betegségben szemved. Egymagvú sejteket különítünk el a perifériás vérből standard centrifugálási technikával Ficoll Paqueon (Boyum A. „Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood” /Egymagvú sejtek és granulociták izolálása emberi vérből/, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, Suppl. 97,77-89 /1968/), és kétszer mossuk kalcium-magnézium-mentes, foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal, mielőtt 1 ml 90% borjúembrió szérumot (FBS) és 10% dimetüszulfoxidot tartalmazó keverékkel szuszpendálnánk, majd -196 'C hőmérsékleten lefagyasztjuk. Amikor az, egymagvú sejteket transzformálni kell, egy 5.10 'sejtet tartalmazó apmullát gyorsan felengedtetünk 37 “C hőmérsékleten. A sejtszuszpenziót 10 ml Iscove-féle tápközegbe adjuk, amely 15% FBS-t is tartalmaz, és szobahőmérsékleten 10 percen át centrifugáljuk 250 xg-vel. Az egymagvú sejteket T-sejtekkel (limfocitákkal) kimerítjük, módosított E-rozettaképzési eljárást alkalmazva. Röviden, a sejteket újra szuszpendáljuk 1.10' sejt/ml koncentrációban PBS-ben, amely 20% FBS-t is tartalmaz, 4 ”C hőmérsékleten. Ennek a szuszpenziónak 1 ml-ét 17x100 mm kerddénekű polisztirol csőbe helyezzük, amelybe 1.10 , 2-amino-etil-izotiurónium-bromiddal (AET) kezelt birka vörösvérsejtet adunklscove tápközegben levő 10%-os (térfogat/térfogat) oldatból (Madsen M. és Johnson H.E. , A Methodological Study of E-Rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells” (Módszertani tanulmány az E-rozetta képződésről, AET- vel kezelt birka vörös vérsejteket alkalmazva), J. Immun. Methods, 27, 61-74 /1979/). A szuszpenziót 13 élénken keverjük 5-10 percen át 4 °C hőmérsékleten és az E-rozettát képző sejteket centrifugálással eltávolítjuk FicoU-Paque-n át, 8 percig 2500 xg-nél, 4 °C hőmérsékleten centrifugálva. Az E-rozetta negatív perifériás vér egymagvú sejteket (E PMBC), amelyek a felületen kötődnek, egyszer mossuk Iscove tápközegben (a GEBCO, Grand Island N.Y. USA cégtől beszerezhető termék) és ugyanebben felszuszpendáljuk, amely azonban tartalmaz még 15% (tömeg/ térfogat) FBS-t (g/ml), L-glutamint (2 mmól/1), nátrium-piruvátot (1 mmól/1), penicülint (100 nemzetközi egység/ml), streptomicint (100 |xg/ml), hipoxantint (l.lO^mól/l), és timidínt (1,6.10 naól/1). Ezt a tápközeget a továbbiakban HAT tápközegnek nevezzük. B. Perifériás vér egymagvú sejtek sejt-hajtott transzformálása Az E PBMC sejt-hajtott transzformálását E PBMC-nek egy transzformáló sejtvonallal való együtt tenyésztésével hajtjuk végre. A transzformáló sejtvonal EBNA pozitív humán limfoblasztoid sejtvonal, amely a GM1500 limfoblasztoid sejtvonal etil-metán szulfonátos mutagenezéséből származott. A 30 |xg/ml 6-tioguanin jelenlétében végzett kiválasztás a sejteket hipoxantin-guanin foszforibozil transzferáz hiányossá teszi, és így HAT- érzékennyé. A sejtvonalat 1A2 sejtvonalnak neveztük, és letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nál (ATCC) 1982. március 29-én ATCC CRL 8119 letéti számon. A logaritmikus növekedési fázisban levő 1A2 sejteket HAT tápközegben szuszpendáljuk és az E PBMC-vel egyesítjük 30 1A2 sejt/1 E PBMC arányban. A sejtkeveréket 10 kerekfenekű 96 üreges mikrotitráló lemezre helyezzük 62000 sejt/üreg koncentrációban, 200 pl/üreg térfogatban, és a tenyészetet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 6% C02-t tartalmazó nedvesített atmoszférában. A tenyészetet a transzformációtól számítva 5 nap múlva tápláljuk olyan módon, hogy a felülúszó felét friss HAT tápközeggel helyettesítjük. Az üregeket minden második nap megfigyeljük inverz mikroszkópon a sejtburjánzás jeleire. Tíz nappal a sejtkeverék lemezre helyezése után és az után, hogy az 1A2 sejtek elpusztultak a HAT szelekció következtében, az üregek rátlálását új tápközegkiszereléssel hajtjuk végre, amely azonos a HAT tápközheggel, azzal a különbséggel, hogy hiányzik belőle az aminopterin komponens. 15 nappal a lemezre helyezés után megfigyelhető, hogy az üregek 100%-a tartalmaz burjánzó sejteket, és hogy az üregek többségében a sejtek elegendő sűrűségűek az anti-E. coli vagy anti-S. marcescens antitestekhez szolgáló felülúszók eltávolításához és vizsgálatához. C. Fajlagos antitest kiválasztó sejtek kimutatása Felülúszókat vizsgálunk át anti-E. coli vagy anti- S. marcescens antitestekre, enzimmel kötött immuno-szorbens mérési technikát (ELISA) alkalmazva (Engvall E.: „Quantitative Enzyme Immunoassay (ELIS) in Microbiology” (Kvantitatív enzimes immunoassay (ELISA) a mikrobiológiában), med. Biol. 55,193-200 /1977/).Az antigén lemezek 96 üreges Immunion 2 mikrotitráló lemezek sorozatából 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
