203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B rendelkeznekKl kapszuláris szerotípussal is. Mások a KI tok hőlabilitásának előnyeit használták ki, hogy megállapítsák ennek jelenlétét. Ki pozitív E. coli szerotípusok melegítése forró vízfürdőben 100 °C hőmérsékleten 60 percen át eltávolítja ezeknek a törzseknek ez után azt a képességét, hogy reagáljanak anti-Kl szérumokkal, és növeli azt a képességüket, hogy reagáljanak anti-0 antigén szérumokkal (Orskov F. és Orskov I. „Serotyping of Escherichia coli”, a Methods in Microbiology” c. kiadványban, 14. kötet /szerkesztő: Bergan T., kiadó: Academic Press, London/ /1984/, 44-105. oldal). A forralás reciprok hatásai legvalószínűbben a tok eltávolításának és ez által az antitestnek a lipopoliszacharid (LPS) molekulákhoz való megnövekedett hozzáférhetőségének tulajdoníthatók. AzE. coli KI pozitív szerotípusokat (07 és 016) és nem KI -nek tipizált szerotípusokat (01 és 050) melegítünk, amint fentebb leírtuk, és reagáltatjuk 9B10 antitesttel és LPS szerotípus fajlagos heterológ szérumokkal (Difco Bacto — E. coli Typing Reagents) ELISA eljárásban. A hővel kezelt organizmusok elvesztik összes reaktivitásukat a 9B10 antitestre, és reaktivitásuk megnövekszik homológ LPS szerotípusú fajlagos szérumokkal, míg a nem kezelt (kontroll) organizmusok erősen reaktívak maradnak a 9B10 tenyészet felülúszóival és gyengén reaktívak a megfelelő LPS szerotípus fajlagos szérumokkal. A Neisseria meningitidis B csoport baktériumaitól származó poliszacharid (szénhidrát), (amely szialinsav, alfa 2,8 -kötött poli-N-acetil-neurominsav homopolimerje) kémiailag és antigenecitás szempontjából egyaránt homogénnek bizonyult (Grados O. és Ewing W. H.: .Antigenic Relationship between Escherichia coli and Neisseria metningitidis” /Antigén-kapcsolat Escherichia coli és Neisseria meningitidis között/, J. Immunol. 110,262-268 /1973/). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a 9B10 monoklonális antitest fajlagosságot tartalmaz E. coli KI kapszulára, akkor az antitest kell, hogy tartalmazzon fajlagosságot N. meningitidis B csoport poliszacharidra is, továbbá hogy a N. meningitidis B csoport policszacharidra való fajlagosságot tartalmazó monoklonális antitestek kell, hogy reaktivitást mutassanak KI tokkal rendelkező E. coli törzsekre. Két kísérleti összeállítást alkalmazunk, hogy megvizsgáljuk (1) a 9B10 antitestnek a N. meningitidis-sel való reagálási képességét és (2) a N. meningitidis B csoport poliszacharid elleni antitestnek a négy E. coli 9B10 reaktív szerotípusával való reagálási képességét. Nagy mértékben tisztított B csoport poliszacharidot (Connaught Laboratories, Toronto, Kanada) és élő N. meningitidis B csoportos baktériumokat reagáltatunk a 9B10 antitesttel ELISA meghatározásban a fentiek szerint. A 9B10 monoklonális antitest erősen reagál mindkét antigén-készítmény ellen. Hogy bebizonyítsuk a fordított fajlagosságot, 31 kereskedelmi forgalomban kapható N. meningitidis B csoport meningitisz vizsgálati készletet (’’Directagen”, Direct Antigen Detection System, Hynson, Westcott and Dunning, Baltimore, Maryland) alkalmazunk, amely B csoport poliszacharid elleni egér monoklonális antitesttel fedett látex gömböket alkalmaz. A 9B10 pozitív E. coli szerotípusokat alkalmazó agglutinációs meghatározásokban mind a négy szerotípus erős reaktivitást mutat az antitesttel fedett gömbökkel. A KI-antigén negatívnak ismert E. coli szerotípusok negatívak ebben a vizsgálati rendszerben. Összességükben ezek az adatok azt jelzik, hogy a 9B10 monoklonális antitest reaktív az E. coli KI tokkal és az N. meningitis B csoporton levő típus-specifikus szénhidráttal. Továbbá mivel ezeket a vizsgálatokat végre lehet hajtani ép, élő baktériumokkal is, arra a következtetésre lehet jutni, hogy a 9B10 monoklonális antitest a poli-szialinsav molekula külsőleg kitett bizonyos részeire fajlagos. 3. A 9B10 monoklonális antitest izotípusát az I. példában leírt fajlagossági vizsgálathoz hasonló ELISA módszerrel határozzuk meg azzal a kivétellel, hogy az antigén lemez PLL-lel immobilizált E. coli KI pozitív szerotípusok gyűjteményeit tartalmazza. A 9B10 monoklonális antitestek pozitív reakcióját a KI pozitív E. coli szerotípusokkal csak anti-IgM reagenssel figyeljük meg, így a monoklonális antitest IgM izotípusát demonstrálva. Azok, akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudják, hogy ha ennek a példának az eljárását többször ismételjük és az így kapott KI -fajlagos monoklonális antitestek izotípusát meghatározzuk, lehet találni további izotípusokat, pl. IgM és IgG izotípusokat. 4. A 9B10 monoklonális anti test in vitro funkcionális aktivitását opszonofagocitás vizsgálatban vizsgáljuk, amely összehasonlítja az antitest bakteriocid aktivitását mind humán neutrofilek, mind humán komplement jelenlétében és távollétében. A KI pozitív E. coli szerotípusok csak a 9B10 monoklonális antitest, egy aktív komplement-forrás, és humán neutrofilok jelenlétében inaktiválódnak (4. Táblázat). Amikor ezt a kísérletet megismételjük több K1 negatív E. coli szerotípussal, a baktériumok elroncsolódása nem következik be (adatokat nem mutatunk be), így ez a 9B10 monoklonális antitest KI fajlagosságát mutatja be, valamint azt a képességét, hogy opszonizálja a baktériumokat és elősegíti fagocitózisukat. Mivel az opszoninok (fajlagos antitestek) és a polimorfonukleáris leukociták (neutrofilek) egyesített akciója tűnik az elsődleges mechanizmusnak a KI pozitív E. coli szerotípusokra való immunitáshoz, ezek az adatok azt sugallják, hogy a 9B10 antitest, megfelelő beadás után, védelmet nyújthat, bármüyen E. coli KI tokos szerotípussal történő halálos kihívás ellen tekintet nélkül ennek O-antigén szerotípusára. 32 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 17
