203580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a GE 2270 antibiotikum A faktor és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 203580B

11

12

ső átmérő) x 250 mm;

első-oszlop: Brownlee Labs RP18 (oktadecfl-szilán szilikagél, 5 (jum);

A eluálószer: acetonitrü: 18 mM—pH 7,0-ra beállított — nátrium-foszfát 70:30 (térfVtérf.),

B eluálószer: acetonitril: pH 7,0-ra beállított 18 mM nátrium-foszfát puffer 10:90 (térfVtérf,),;

az eluálás módja: az A eluálószer lineáris grádiense a B eluálószerben, 45-70% között, 20 perc alatt;

áramlási sebesség: 1,8 ml/perc;

UV detektor: 254 nm;

belső standard: kloramfenikol (Rfc 3,7 perc).

F) elemanalízis- a minta előzetes, kb. 140 *C-on közömbös atomszférában való szárítása után — a következő összetevőkre mutat: C, H, N, S.

G) 0,37 Rf érték a következő kromatográfiás rendszerben:- diklór-metánmetanol 9:1 (tériVtérf.);- szilikagél lemezek (szilikagél 60F2 5/4Merck

c°.);- kimutatás: 254 nm-es UV fény; jód-gőz hatására sárga folt vagy bioautográfia, B. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimál-táptalajon,- belső standard: kloramfenikol (Rfi),56).

H) FAB-MS elemzés: a protonált molekula ion a legkisebb tömegű izotópot m/z 2390,3 ± 1 daltonnál mutatja. 800 m/z tömeg-egység fölött minden csúcs (eltekintve az izotóp csúcsoktól) a spektrumban a molekula-ion 21%-ánál kisebb mennyiségű. Az elemzéstKratosMs-50 kettősfókuszáló tömegspektrométerrel végezzük, a következő kísérleti körülmények között: Xe gyors atom bombázás 6 Kv mellett;

glicerin mátrix;

pozitív ionizációs mód.

I) A sósavas hidrolizátum aminosav-elemzése a következő természetes aminosavak jelenlétére mutat: glicin, L-prolin és L-szerin. A kísérleti körülmények a következők:

A mintát 105 'C-on 20 órán át 6N HCl-ben hidrolizáljuk (amely HC1 1% fenolt tartalmaz), majd két lépésben származékot képzünk, a következő módon:

a) n-propü-észter képzése a karbonsav-funkció igénybevételével, 2M HCl-lel, vízmentes propanolban (90 °C, 1;, majd szárítás nitrogén alatt;

b) a szabad amino-csoportok amiddá való átalakítása 1:9 (térfJtérí.) pentafluor-propionsav-anhidrid: vízmentes diklór-metán eleggyel, szobahőmérsékleten, 1 órán át, majd szárítás nitrogén atmoszférában.

Az így kapott származékot diklór-metánban oldjuk és GC-MS technikával elemezzük HP 5985B rendszer alkalmazásával, a következő körülmények között:- oszlop: királis n-propionü-L-valin-terc-butüamid-polisziloxánnal bevont ömlesztett szUikagél

kapilláris oszlop (25 m x 0,2 mm belső átmérő; C. G. C. ANALYTIC)- hőmérsékleti program: 80 °C 4 percen át, majd 4 “C/perc

5 L) Ionizációs vizsgálatok

0,1N HCl-lel és 0,1N NaOH-dal metü-celloszolv/víz közegben titrálva nem mutatható ki ionizálható funkció; 0,1N HC104-gyel való titrálással nemvizes közegben (ecetsav) egy gyenge bázisos

10 funkció mutatható ki. _ _

M) Fajlagos forgatás [ou l> +140,8, absz. etanolban, kb. 5 g/1 koncentrációban.

A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények antimikrobiális aktivitása in vitro számos

15 standard vizsgálattal kimutatható.

A Clostridium difficile, Propionibacterium acnes és a Bacteroides fragilis esetében az MIC-t agarhímtásos módszerrel határozzuk meg (inokulum: KPCFU/104telepképző egység/). Más mikroorga-20 nizmusok esetében a MIC-t tenyésdé-mikrohígítással mérjük (inokulum: 10-10"5 CFU/ml). Az Ureaplasma urealyticum esetében az inokulum kb. 10 színváltoztató egység/ml. Inkubációs idő 18-24 óra, míg a N. gonorrhoeae, Branhamella catarrhalis,

25 H. influenzae, C. difficüe, P, acnes és a B. fragilis esetében 48 óra. Valamennyi organizmust kb. 37 'C- on inkubáljuk, a Candida albicans kivételével (30 ’C). A M. gonorrhoeae-t és a H. influenzae-t 5% C02-t tartalmazó atmoszférában inkubáljuk, az

30 anaeróbokat pedig anaerob gázelegyben. Az alkalmazotttáptalajok:- Iso-Sensitest leves (Oxoid) a Staphylococcusok, a Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vul-35 garis, Klebsiella pneumoniae esetében;- Todd-Hewitt leves (Difco) a többi Streptococcus esetében;

-GC alap-leves (Difco) + l%IsoVitalexBBL (:N. gonorrhoeae;

40 - agy-szív infúziós leves (Difco) + 1% C adalék

(Difco) a H. influenzae esetében;- Müller-Hinton leves (BBL) a Branhamella catarrhalis esetében;-AC táptalaj (Difco) a C. perfringensesetében;

45 - Wilkins-Chalgren agar (Oxoid) a többi anaerób

esetében (T. D. Wilkins, S. Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10,926,1976);

- Evans-Taylor-Robinson leves (Difco) adalékanyagokkal az U. urealyticum esetében;

50 - élesztő-nitrogén leves (Difco) a Candida albicans esetében.

Egyes mikroorganizmusok minimális gátló koncentrációját (MIC, pg/ml) a IV. táblázatban mutatjuk be.

55 Az alábbi táblázatokban a MIC5 Gés MIC9 (X kezelt törzsek 50/-ának illetve 90%-ának gátlásához szükséges minimális koncentrációt jelentik.

7