203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 HU 203 578 B 2 lacZ a-fragmentum kifejeződése valamely E. coli AM15 törzsben, pl. E. coli K12 RR1AM15 (NRRL B- 15440) törzsben, helyreállítja a törzsnek azt a képességét, hogy funkcionális p-galaktozidás enzimet termeljen. így a pOJlőO plazmid helyreállítja a ß-galaktozidáz aktivitást az E. coli K12 RR1AM15 törzsnél. A DNS beiktatása azonban a pOJ160 plazmidon levő polilinker restrikciós helyébe, ahogyan ez a POJ325 megalkotásánál történik, szétroncsolja a lacZ a-fragmentum kódoló szekvenciát, következtében elpusztítja a pOJlőO plazmid származéknak azt a képességét, hogy kiegészítse a M15 mutációt. A ß-galaktozidäz hidrolizálja az X-gal-t (5-br0m-4-kl0r-3-indolil-ß-D- galaktopiranozid, színtelen vegyület) indigó-színű termékké és így kényelmes átvizsgálási lehetőséget nyújt a transzformánsok megkülönböztetésére, megkülönböztetve azokat a plazmidokat, amelyek a pOJlőO kiindulási plazmidot tartalmazzák, azoktól a plazmidoktól, amelyek egy pOJ 160 származékot, pl. pOJ325 plazmidot tartalmazzák. AzE. coliK12RRl M15 sejtek, amelyek transzformációhoz kompetensek, előállítására az NRRL-től kapott E. coli K12 RR1AM15 liofüizátumot helyreállítjuk, hogy egyedi telepeket izolálhassunk. Az RR1AM15 egy egyedi telep izolátumát 10 ml L-tápközegbe inokuláljuk (10 g Bacto-tripton, 10 g NaCl, 1 gBacto-élesztőkivonat literenként), és a tenyészetet 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. Az egy éjszakán át nőtt tenyészetet alkalmazzuk 200 ml L-tápközeg inokulálására, hogy mintegy 0,1 OX>600 értékű tenyészetet kapjunk. A tenyészetet 37 ‘C hőmérsékleten inkubáljuk, amíg az OD600 érték eléri a 0,6-ot. A tenyészetet 4000 g-n, 10 percen át, 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 100 ml hideg, 50 mmól/l-es CaG2 oldatban és jégen inkubáljuk 15-30 percig. A sejteket ismét összegyűjtjük centrifugálással és újra szuszpendáljuk 10 ml hideg, 50 mmól/l-es, 20% glicerint tartalmazó CaCl2 oldatban. A sejtek 200 pjnyi alikvotjait adjuk a fenti ligáit DNS-hez. A sejt- DNS keveréket jégen inkubáljuk egy órán át, centrifugáljuk, és a sejtüledéket újra szuszpendáljuk egy órán át, centrifugáljuk 0,5 ml L-tápközegben, 1,5 ml-es csőben, és levegőztetés mellett inkubáljuk 37‘C hőmérsékleten 1/2 órán át. A transzformáns keverékből alikvotokat szélesztünk L-agar (L-tápkőzeg 15 g/liter agarral) lemezekre, amelyek 200 pg/ml apramicint, 40 pg/ml X-gal-t és 40 p.g/ml IPTG-t tartalmaznak. Az IPTG arra szolgál, hogy derepresszálja a pOJlőO plazmidon jelen levő lac promotort. A lemezeket 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. Azok a telepek, amelyek beiktatás nélküli plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli KI 2 RRlAM15/pJO160, kék színnel tűnnek elő ezeken a lemezeken. Azok a telepek, amelyek beiktatással rendelkező plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli K12 RRlAM15/pOJ325, fehérek. Számos apramicinrezisztens, fehér telepet választunk ki, majd plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével átvizsgáljuk ezeket. Amint a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és működési térképben feltüntettük, amikor egy BaHI átfedést ligálunk egy Bgin átfedéshez, XhoII helyet hozunk létre. Sem a BamHI, sem a BglII nem hasítja azonban a BamHI-gyel hasított fragmentumnak a BglII-vel hasított fragmentumnak a Bglü-vel hasított fragmentumához való egyesítéséből, és ezeket be lehet iktatni a BamHI-gyel emésztett pOJlőO plazmidba. Az ilyen nem kívánt vektorokat úgy különböztetjük meg a pOJ325 plazmidtól, hogy Aha Hl és Xbal restrikciós enzimekkel emésztünk. Ezek a helyek a pOJ171 plazmidnak olyan részeiben vannak jelen, amelyek a pKC 462A plazmidból származnak, így jelen vannak a pOJ171 plazmid nem kívánt -14 kb-s Bgin restrikciós fragmentumaiban, de teljesen hiányzanak a pOJ171 S.thermotolerans DNS beiktatási részében, amely a carG gént tartalmazza. A plazmid DNS-t az E. coli K12 RRlAM15/pOJ325 transzformánsokkal kapjuk meg, a pOJlőO plazmid DNS izolálására alkalmas, fentebb leírt eljárás szerint. A pOJ325 plazmid DNS-t lehet alkalmazni Streptomyces thermotolerans transzformálására, amint ezt a 3. példában leírjuk. 3. példa Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270) transzformálása S. thermotolerans/pOJ 171 és S. thermotolerans/pOJ325 előállítására K.Az oldatok jegyzéke Az alábbi oldatokra utalunk a példák során, ezeket az egyértelműség kedvéért itt megadjuk. 1. P tápközeg (-100 ml): Alkotórész Mennyiség Szacharóz 10,3 g K2S04 0,025 g Nyomelemoldat (lásd 2.) 0,2 ml MgCl2.6H20 0,203 g víz Autoklávozás után hozzáadandó: 80 ml KH2P04 (0,5%) 1 ml CaCl2.2H20 (3,68%) [N-trisz-(hidroxi-metü)-metü-2-amino-etán-szulfonsav], ”TES” puffer, 0,025 mól/1 (pH 7,2) 10 ml 2. Nyomelemoldat (-11) Alkotórész Mennyiség ZnCl2 40 mg FeCl3.6H20 200 mg CuC12.4H20 10 mg MnCl2.4l40 10 mg Na2B4O7.10H2O 10 mg (NH4)6M07024.4H20 10 mg h2o 11 3. R2 regeneráló tápközeg (-11) Alkotórész Mennyiség Szacharóz 103 g K2S04 0,25 g Nyomelemoldat 2 ml MgCl2.6H20 10,12g 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 56 60 10
