203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 HU 203 578 B 2 4. példa A. Lemez-dugó vizsgálat Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270) pOJ325 transzfonnánsokat viszünk át R2-agar regeneráló lemezekről Bennett agar (3A12) és 25 p,g/-ml apramicint tartalmazó lemezekre, és 37 'C hőmérsékleten inkubálunk 2-3 napon át, amíg a telepek 5- 10 mUliméter átmérőjűek lesznek. A telepeket azután küékeljiik és a dugókat átvisszük, steril átvivő csöveket (Spectrum Medical Industrial, Inc. Los Angeles, Kalifornia 90054) alkalmazva, triptikázszója agar (TSA) lemezekre, amelyeket előzőleg felülrétegezünk lágy-agar tápközeggel (Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48232), amely Micrococcus Luteus X160- at (ATCC 9341) tartalmaz. A lemezeket 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk 16-24 órán át, A Micrococcus Luteus (ATCC 9341) érzékeny karbomicinre és rezisztens apramicinre. Következésképpen ez a M. Luteus törzs nem képes nőni olyan dugó körül, amely karbomicint termelő Streptomycest tartalmaz. A lemezdugó vizsgálatokban, amelyeket S. thermotolerans vad-típusú sejtekkel (ATCC 11416), S. thermotolerans (NRRL 15270/pOJ235-tel és S. thermotolerans (NRRL 15270ypOJ171-gyel végzünk, a M. luteus növekedés gátlásának világos zónái láthatók a dugók körül. Ezek a gátlási zónák kb. 20-25 mm mérettel, amelyek a S. thermotolerans NRRL 15270 dugók közül hiányoznak, jelzik, hogy a transzformánsok termelnek karbomicint. B. Bioautogrdfia Számos dugót készítünk a 4A példában alkalmazott, Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270ypOJ325-öt tartalmazó lemezekből. A dugókat vékonyréteg kromatográfiás lemezre (Merck, P.O. Box 2000, Rahway, New Jersey 07065, előre burkolt szilikagél #60 F-254) helyezzük a karbomicin standard mintájához közel. A dugókat a lemezeken annyi ideig hagyjuk, amely elegendő, hogy diffúzió következzék be; ezután a lemezeket felszálló folyadékkromatográfiának vetjük alá etü-acetát:dietü-amin:metanol 95:5:5 rendszerben. A kifejlesztett kromatogramokat alaposan megszárítjuk szívófülkében, legalább két óráig. A kromatogramokat azután lappal lefelé Micrococcus luteus X160-nal beoltott TSA lemezekre helyezzük mintegy 15 percre. A kromatogramokat a lemezekről eltávolítjuk, és a lemezeket inkubáljuk 37 *C hőmérsékleten 16-24 órán át. A Streptomyces thermotolerans/pOJ325 transzformánsokból készített dugókhoz tartalmazó kromatogramok gátlási zónákat alakítanak ki, amely a kromatogramon levő anyagok eredménye, amelyek együtt vándorolnak a karbomicin standarddal. C.Fermentálás Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, S. thermotolerans NRRL 15270 és S. thermotolerans (NRRL 15270)/pOJ325 tenyészeteit növesztjük 25 pg/ml apramicint tartalmazó Bennett tápközeg ferde tenyészetem. Ezeket a tenyészeteket külön-külön alkalmazzuk vegetatív tápközeg több 50 ml-es alikvotjának inokulálására. A vegetatív tápközeg 27,5 g triptikáz-szója tápközeget tartalmaz 1 liter ionmentesített vízben. Az inokulált tápközeg minden 50 ml-es alikvotját 250 ml-es Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 37 ‘C hőmérsékleten 48 órán át levegőn rázó inkubátorban, amely 5,08 cm-es köríven forog 260 fordulat/perccel. Az egyes vegetatív tenyészetek 2 ml-es alikvotjait használjuk CSI (3A10) fermentációs tápközeg több 50 ml-es alikvotjának inokulálására. Az inokulált fermentációs tápközeg minden 50 ml-es alikvotját 48 órán át inkubáljuk 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 37 °C hőmérsékleten, levegőn rázó inkubátorban, amely 5,08 cm-es köríven forog 260 fordulat/perccel. Az egyes fermentációs tenyészetekből minden 24 órában kiveszünk 20 ml-t, és vizsgáló korongra helyezzük [1/2” (-1,27 mm), Schleicher és Schuell AnalyticalPaper]. Megszáradás után ezeket a korongokat Micrococcus luteussal beoltott agar lemezekre helyezzük. A lemezeket azután 37 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. A gátlási zónákat mérjük és rögzítjük. A fermentáció 48 órája után 400 ml teljes tápközeget minden tenyészetből pH 8,5-re állítunk be 1 n Na- OH-val, és háromszor extraháljuk etü-acetáttal. Az így keletkezett szuszpenzió etil-acetátos részét eltávolítjuk és Rotavapor-EL-en (Büchi) szárazra koncentráljuk. A nyers, szárított készítményt metanolban szuszpendáljuk, és fordított fázisú HPLC-vel elemezzük, Rainin Dynamax 150-C8 oszlopot (4,5 x 350mm) alkalmazva. A karbomicint 55% acetonitrü/víz/nátrium-perklorát (0,1 mól/1, pH 2,3) rendszert alkalmazva vizsgáljuk, 2 ml/perc áramlási sebességnél. A karbomicint 239 nm-nél UV abszorpcióval mutatjuk ki. A mennyiségi összehasonlítást karbomicin-standardot (Pfizer, 2 mg/ml) alkalmazva végezzük. Amint ezt HPLC-vel mérjük, a Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270/pOJ325 4,8-szor több karbomicint termel, mint a S. thermotolerans ATCC 11416. A S. thermotolerans NRRL 15270 nem termel karbomicint. Az antimikrobiális aktivitás alapján mérve a Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270)/pJO325 több antibiotikumot termel, mint akár a S. thermotolerans ATCC 11416, akár a S. thermotolerans NRRL 15270. 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 12
