203577. lajstromszámú szabadalom • Delta-endotoxint tartalmazó inszekticid készítmények és eljárás inszekticid hatású delta-endotoxin előállítására
korábban már említett hígítószereken és felületaktív anyagokon kívül egyéb ismert agrokémiai segédanyagokat, például diszpergálószereket, fagyásgátlókat és/vagyUV-stabüizátorokat is felhasználhatunk. A találmány szerinti kompozíciók igen előnyösen alkalmazhatók lepkefélék, köztük Choristoneura fumiferana, Lymantria dispar, Trichoplusia ni, Heliothis zea, Spodoptera exigua, Plutella Xylostella és Ostrinia nubialis irtására. A találmány szerinti kompozíciók igen sokféle, lepkekártevőre érzékeny növényvédelmére alkalmasak. A találmány szerinti kompozíciókat jó eredménnyel alkalmazhatjuk például kukorica és toboztermők, továbbá rizs, aprómagvas ganofélék (így búza és árpa) és zöldségfélék (így saláta, paradicsom és cukorrépa) védelmére. A találmány tárgya továbbá eljárás inszekticid hatású 5-endotoxin előállítására Bacillus thuringiensis mikroorganizmus-törzs fermetálásával. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Skócia) törzsgyűjteményben NCIB12570 számon letétbe helyezett Bacillus thuringiensis A20 törzset vagy az ugyanott NCIB12571 számon letétbe helyezett Bacillus thuringiensis A29 törzset nitrogénforrást és szénhidrát-forrást tartalmazó táptalajon 15-45 ’C-on 1-3 napigfermentáljuk, majd a fermentléből ismert módon elkülönítjük a 6-endotoxint tartalmazó spórákat és kristályokat. A találmányt az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban kereskedelmi névvel vagy védjegynévvel jelölt komponensek kémiai összetétele a következő: Morwet ID-425: natalin - formaldehid kondenzátum nátriumsója Synperonic NPE-1800: nonU-fenol etilén-oxiddal képezett kondenzátuma Tween 80: poli-oxi-etüén-szorbitán-monooleát Klezan: xantángumi Veegum HV: hidratált magnézium-alumínium-szilikát Sorbo: 70:30 tömegarányú vizes szorbit-oldat 1. példa A Bacillus thuringiensis A20 törzs elkülönítése Egy coburgi (Ontario, Kanada) cédrusfa alól vett talaj 0,5 g-os mintáját 45 ml 0,05 tömeg/térfogat%-os pepton oldatot tartalmazó hígító lombikba helyeztük, és így 10'1 arányú hígítást készítettünk. A mintát 10 percre 60 'C-os vízfürdőbe merítettük. Ezután sorozathígítást végeztünk úgy, hogy a mindenkori leghígabb minta 0,5 ml-es részletét 4,5 ml 0,05 tömeg/térfogat%-os pepton oldathoz adtuk (0,5 ml 10'1-szeresre hígított mintát 4,5 ml pepton oldathoz adva például 10'2-szeres hígítást értünk el), és így 10~5-szörös hígítást készítettünk. Bacillus cereus agar-alap (CM617 kódjelű termék, gyártja az Oxoid vég, Kanada) és eszkulin-agar (összetétele g/1 liter víz egységekben: eszkulin: 1,0, vas(HI)-citrát: 0,5, pepton: lO.nátrium-klorid: 5 agar: 20) felhasználásval Bacillus cereusra szelektív lemezeket készítettünk, a lemezekre a 10~3 * - 10’6-szoros hígításokat vittük fel, ezután a lemezeket 5 napig 30 *C-on inkubáltuk, majd Bacillus thuringiensis tele-1 HU pék jelenlétére vizsgáltuk. A kiválasztott telepeket Smirnoff módszerével festettünk, és a metszeteket 1000-szeres nagyítású, olajba merülő lencséjű mikroszkóp alatt vizsgáltuk sötétre színeződött, rendszerint (de nem szükségszerűen) kettős piramis alakú parasporális kristályok jelenlétére. A kristályokat tartalmazó telepeket tápagarra rétegeztük, és az így kapott tiszta tenyészeteket további 5 napig 30 ’C-on inkubáltuk. Ezután a kristályok jelenlétének igazolására és a tisztaság vizsgálatára ismét elvégeztük a Smirnoff-féle festést. A tisztított telepeket ferde tápagar lemezekre vittük át, és további felhasználásig hűtőszekrényben 40 *C-on tároltuk. 2. példa A Bacillus thuringiensis A29 törzs elkülönítése Ezt a törzset elpusztult burgonyabogár-lárvából különítettük el. A rovart kevés pepton hígítószerrel együtt sterilizált dörzsmozsárban sterilizált mozsártörővei eldörzsöltük. A folyadékfázist Pasteur-pipettával elkülönítettük, és 45 ml 0,05 tÖmeg/téforgat%-os vizes pepton oldatot tartalmazó kémcsőbe mértük be. Az így kapott oldatot tekintettük 10"1-szeres hígításnak. A mintát 10 percre 60 ’C-os vízfürdőbe merítettük. Ezután sorozathígítást végeztünk úgy, hogy a mindenkori leghígabb minta 0,5 ml-es részletét 4,5 ml 0,05 tömeg/térfogat%-os pepton oldathoz adtuk (0,5 ml 10''-szeresre hígított mintát 4,5 ml pepton oldathoz adva például 10'2-szeres hígítást értünk el), és így 10‘5-szörös hígítást készítettünk. Bacillus cereus alap-agar (CM617 kód jelű tennék, gyártja az Oxoid cég, Kanada) és eszkulin-agar (összetétele g/1 liter víz egységekben: eszkulin: 1,0 vas(ÜI)-citrát: 0,5, pepton: 10, nátrium-klorid: 5, agar 20) felhasználásával Bacillus cereusra szelektív lemezeket készítettünk, a lemezekre a 10' - 10'6-szoros hígításokat vittük fel, ezután a lemezeket 5 napig 30 ‘C-on inkubáltuk, majd Bacillus thuringiensis telepek jelenlétére vizsgáltuk. A kiválasztott telepeket Smimoff módszerével festettük, a megfestett telepekből mikroszkópos metszeteket készítettünk, és a metszeteket 1000-szeres nagyítású, olajba merülő lencséjű mikroszkóp alatt vizsgáltuk sötétre színeződött, rendszerint (de nem szükségszerűen) kettős piramis alakú parasporális kristályok jelenlétére. A kristályokat tartalmazó telepeket tápagarra rétegeztük, és az így kapott tiszta tenyészeteket további 5 napig 30 *C-on inkubáltuk. Ezután a kristályok jelenlétének igazolására és a tisztaság vizsgálatára ismét elvégeztük a Smimoff-féle festést. A tisztított telepeket ferde tápagar lemezekre vittük át, és további felhasználásig hűtőszekrényben 4 ‘C-on tároltuk. 3. példa A Bacillus thuringiensis törzsek tenyésztése 100 ml CRL 1-es közeget (összetétele g (vagy ml/1 liter víz egységekben: tápfolyadék: 8, glükóz: 6, élesztőkivonat: 5, xilóz: 0,5, gyapotmagliszt-extraktum: 30 ml, kukoricalekvár: 3,2 ml, Mary Mendel-féle sókeverék: 1 ml) tartalmazó 250 ml űrtartalmú Erlenmeyer lombikba az A20 törzs oltóanyagát juttattuk a ferde 577 B 2 203 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
