203565. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulatömegű heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát és sóik, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 565 B 2 6. Táblázat folytatása Termék N# perc mcg/ml AUC* Heparin 1 0 0 2 15 1,9 3 30 2,4 4 60 4,6 426 5 120 0,95 6 240 0,85 ♦Görbe alatti terület A görbék alatti terület (AUC) összehasonlítása 11. példa alapján az előállított LMW biológiai hasznosíthatósá-Az 5. példának megfelelően depolimerizált dermaga nyolcszorosa a nagy molekulatömegű heparinénak. tán-szulfát (DS) 7. táblázatban található jellemzőit a nem depolimerizált termék jellemzőivel hasonlítottuk össze. 7.: Táblázat Termék U-APTT U-AXa Molekula-S% Uronsav-S03H/ tömeg /-COOH DS 37 24,1 14000 6,8 27,4 1,51 LMW-DS 5,2 25,3 3000 7,7 27,8 1,67 A kísérleti trombózisos modellben a bélcsatomán keresztül a találmány szerinti eljárással előállított LMW-DS terméket adagoljuk patkányoknak. Az LMW-DS EDS0 érték (a trombusok tömegének felezéséhez) 6,9 mg/kg, miközben ugyanez az érték nem depolimerizált DS esetében 8,9 mg/kg. Az LMW-DS fibrinolitikus hatásúnak bizonyult. 12. példa 10 g dermatán-szulf átot OP 239 [amely a következő molekulatömegű termékek elegye: 19% 20000: 30% -14000,50% ~12000 (HPLC-s meghatározás) és [ajp -60] 100 ml vízben 250 mg réz-acetáttal összekeverünk (10 g/100 ml-es oldat). Egy óra alatt az elegyhez adunk 37-40 'C hőmérsékleten 30 ml 15%-os hidrogén-peroxidot. Az elegy pH-ját 14 ml 1 n NaOH-val 7,5-n tartjuk. A reakció végén az oldatot 20 °C-ra hűtjük és a pH-t ecetsavval 5,8-ra csökkentjük. Az elegybe két térfogat metanolt adunk, és az így keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk, majd feloldjuk 60 ml vízben és Chelex 100^ gyantával töltött oszlopon (2x18 cm) eluáljuk. A kapott oldatot a kolonna mosóvizével együtt 2 térfogat metanollal elegyítjük. A keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk és szárítjuk, ily módon 6,11 g (61% kitermelés) dermatán-szulf átot kapunk. A termék jellemzői: [a]—59,3; S-6,7%; iduronsavak- 30,7%; S03Heq/COOHeq-1,32 átlagos molekulatömeg- 4800 dalton (Protein Pák 125 kolonnán (Waters) végzett HPLC alapján). Belső standardként metanolt és külső standardként tetrametil-szüánt alkalmazva megállapítottuk a 12 13CNMR kémiai eltolódásokat. A metanol kémiai eltolódása DzO-ban a tetrametilszüánra vonatkoztatva 30 51,75 ppm. A következő kémiai eltolódást kaptuk L- idozüuronsavra (U) és acetamido-dezoxi-D-galaktózra (A) (jelezve a szénatomokat, amelyekhez az értékek tartoznak): 8 (ppm): 104,8 (Uj), 103,6 (Aj), 82 (A3), 77,73 (U4), 76,94 (A*), 76,08 (A5), 72,7 (U3), 70,9 35 (U2_5), 60,72 (A6), 52,9 (Af), 25.7 (CH3). A redukáló terminális csoportok (Aj és Uj) jelei a 90-95 ppm tartományban magától értetődőek. In vitro alkalmazásban: U-AXa/ 2,5 nemzetközi egység/mg és U-APTT -1,3 nemzetközi egység/mg. 40 A Hladoves szerinti (Physiologia Bohemoslovaca, 24, 551, 1975) kaolinos trombózis vizsgálatban: ED50-1,2 mg/kg. 13. példa 45 5 g 7-8 HF dermatán-szulfátot [molekulatömege 34000 (HPLC)] 5 g nátrium-acetáttal együtt 100 ml vízbe adunk (5 g/100 ml-es oldat). Az elegyhez adunk 230 mg réz-acetát-monohidrátot és egy óra alatt hozzácsepegtetünk 20 ml 12%-os 50 hidrogén-peroxidot. A hőmérsékletet 30-38 *C-on, a pH-összesen 5 ml 0,1 nNaOH-oldattal 7,5-n tartjuk. A reakció végén az elegyhez adunk 500 mg EDTA dinátrium-dihidrátot, a pH-t ecetsavval 5,9-re beállít- 55 juk és a depolimerizált terméket két térfogat metanollal kicsapjuk. A terméket az előző példa szerint feldolgozzuk. íly módon 2,95 g OP 116 terméket (59% kitermelés) kapunk. 60 9
