203565. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulatömegű heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát és sóik, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 Hü 203 565 B 2 Az így kapott oldathoz adunk 350 g nátrium-acetátot, 20 g EDTA-t, majd a pH-t 5,8-ra beállítjuk és 20 liter metanolt adunk hozzá. A keletkező csapadékot összegyűjtjük, metanollal és acetonnal mossuk, és szárítjuk. íly módon 845,5 g (84,5% kitermelés) kis 5 molekulatömegű fehér heparint kapunk, amelynek jellemzői a következők: molekulatömeg: 4600 dalton U-APTT: 34,4 U-AXa: 72,5. Az itt megadott eljárás különböző szakaszaiban vett oligoszacharid minták átlagos molekulatömegét, valamint analitikai jellemzőit és biológiai aktivitását a következő 2. táblázatban közöljük. 2. Táblázat Idő Átlagos molekulatömeg U-APTT * U-AXa S% Uronsav-so3hz /-COOH 0 13400 126,7 107,1 8,72 25,82 2,05 15’ 11200 98,4 30’ 9400 86,9 60’ 8100 62 89,6 9,58 27,96 2,07 90’ 6900 50,2 120’ 5200 36 73 Nyers csapadék 4600 34 73 9,65 28,16 2,08 (*)Az átlagos molekulatömeg (x) és az U-APTT (y) közötti korreláció egyenes egyenlete a következő: y- 0,0108055 x -20,1658 (r-0,9925) Az így kapott nyersterméket 6 liter vízben feloldjuk és mintegy 2 térfogat/óra sebességgel erősen bázisos, OH' formájú anioncserélő gyantával (amberlit típusú) töltött kolonnán (100 mm átmérőjű, 650 mm magas) átvezetjük. Az eluátumhoz annyi ecetsavat adunk, hogy pH-ja 5 legyen, majd 2 liter enyhén savas kelát 30 gyantán átvezetjük. Az eluátumból metanollal kicsapjuk a terméket, amely 803,2 g igen tiszta kis molekulatömegű heparin (LMW OP144). Az atomabszorpciós vizsgálat szerint a termék rezet nem tartalmaz. 35 A redukáló terminális csoportok jelei a 13C-NMR spektrumban az anomer területen találhatók. A kapott eltolódási értékek (@d#): N-szulfatált glükóz-amin C-l: 92,7 ppm és a 2-0-szulfatáltiduronsavC-l:94,4ppm. 40 A spektrumot D20-ban 20 MHz-n vettük fel. Belső standardként metanolt alkalmaztunk, amelynek kémiai eltolódása 51,75 ppm. 4. példa 45 Az alábbiakban leírt folyamatban 25 g, előzetesen a 3. példában megadottal analóg módon depolimerizált heparint (OP 84/0410) egy további depolimerizálásnak vetjük alá. A kiindulási anyagul szolgáló depolimerizált heparin jellemzői: U-APTT/mg- 7; UAXa/mg- 52; in vivo antitrombotikus aktivitás 116; molekulatömeg 3300). 25 g, az előbbiekben jellemzett LMW-heparint (LMW itt és a leírás más helyein: kis molekulatömegű) öntünk 200 ml vízben oldott 0,75 g réz-acetáthoz (12,5 g/100 ml-es oldat). Ezután két óra alatt 180 ml 16%-os hidrogén-peroxidot adunk az elegyhez, és a hőmérsékletet 65-70 °C-on tartjuk. A pH-t 7,4-en tartjuk, amelyet NaOH-oldattal állítunk be. Az így kapott reakcióoldatot lehűtjük, a pH-t 6-ra állítjuk be, és Chelex 100^ kolonnán (2,8x13 cm), ezt követően Amberlite^ kolonnán (OH' formájú IRA-400, 4,2x8 cm-es oszlop), végül pedig egy erősen savas H+ formájú polisztirol kolonnán vezetjük át. Az eluátum pH-ját NaOH oldattal 7-re beállítjuk és fagyasztva szárítjuk. íly módon 19,55 g (78,2% kitermelés) kis molekulatömegű OP 119 heparint kapunk. (A termék jellemzőit a kiindulási vegyülettel összehasonlítva a 3. táblázatban adjuk meg.) 3. Táblázat Termék Molekulatömeg S% Uronsav%-S03H/ /-COOH P 85/0410 3300 10,78 31,23 2,09 VLMWOP119 1900 7,3* 20,8* 2,12 Megjegyzés: * Az igen kis molekulatömegű termékből egy alikvot mennyiséget visszatartott az anionos kolonnán, ez magyarázza a kén és az uronsav %-os értékének csökkenését. Valójában az 'S03 eq/'COOH e értékek változatlanok. 6
