203561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adenozin-származékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 561 B 2 r vagy metil-paraben; antioxidánsokat, így aszkorbinsavat vagy nátrium-biszulfitot; kelátokat, így etilén-diamin-tetraecetsavat; puffereket, ilyenek az acetátok, citrátok vagy foszfonátok; végül tartalmazhatnak ezek a készítmények tonicitás szabályozó szereket is, Uyen 5 a nátrium-klorid vagy dextróz. A parenterális készítmények üveg vagy műanyag ampullák, osztható fecskendők vagy többszörös dózisú fiolák alakjában készülhetnek el. A fentiekben ismertetett gyógyszerkészítmények 10 bármelyike az (I) képletű hatóanyag mellett valamilyen ADA inhibitor effektiv gátló mennyiségét is tartalmazhatja a fent felsorolt adalékanyagok mellett. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények hatásosságát az alábbi farmakológiai vizsgálat eredményei 15 mutatják. SAH inhibitor aktivitás és vírusellenes hatás A találmány szerinti vegyületek S-Adenozü-L-Homocisztein hidroláz (SAH hidroláz) inhibitor akti vita - 20 sát és vírusellenes hatását az alábbiak szerint bizonyítottuk. SAH hidroláz aktivitás Az 1. táblázatban mutatjuk be a SAH hidroláz inhibícióra vonatkozó kinetikus adatokat. A Kx és K^, értékeket az i és 2 vegyületekre adjuk meg, ezek mindegyike időfüggő inhibíciós hatást mutat. Patkány máj SAH hidroláz vizsgálat: patkány májból származó SAH hidrolázt tisztítottunk Fujioka és Takata (J. Bioi. Chem. 1981. 256, 1631) módszerével és hirolitikus szempontból vizsgáltuk folyamatosan figyelve szubsztrát és inhibitor jelenlétében. Az L-homocisztein képződést spektrofotometriásán követtük, lényegében Wolfson és társai (J. Bioi. Chem. 1986. 261,4492) módszere szerint eljárva. .Az időfüggő inhibitorok esetében a folyamat görbék exponenciális görbék alakját veszik fel, ezekből megkaptuk a pszeudo elsőrendű sebesség konstansokat (kobs) különböző inhibitor koncentrációknál. A Kj és értékeket az ^obs-^inhibitorl görbéből kaptuk meg. A táblázat a SAH Hidroláz InLibícióra vonatkozó kinetikus konstansokat tartalmazza. Vegyületek Időfüggő inhibíció Kj^M) patkánymáj SAH hidroláz3 •^inact (perc-1) 1 igen 8,4 0,7 2 igen 0,1 0.1 “hidrolitikus szempontból vizsgálva 1 vegyület-9-(5,5,6,6-tetrahidro-5,6-didezoxi-ß-D-ribohexoi'uranozil)-9H-purin-6-amin 2 vegyület- 9-(ß-D-ribofuranil-nitril)-9H-purin ő-amin Vírusellenes hatás A vírusellenes hatást plakk csökkentési vizsgálatban határoztuk meg DNA vírus vakcinát használva. Vakcinia vírus jelenlétében meghatározzuk a plakk képződés 50%-os csökkentésére vonatkozó minimális gátlókoncentrációt (IC50). A plakk vizsgálatokat VERŐ sejtekben végeztük. A 40 közeget leszívattuk mindegyik egyrétegű sejtkultúrából és 0,2 ml vírust, amelyet fenntartó közeggel hígítottunk, úgy, hogy 20-80 plakk képző egységet (PFU) adjon, majd 60-80 percig, 37 "C-on hagytuk adszorbeálódni egy nedvesített széndioxid inkubátorban. Ez 45 idő elteltével a vírus feleslegét leszívattuk és minden egyrétegű sejtkultúrát egyszer mostunk 1,0 ml fenntartó közeggel. Ezután minden VERŐ egyrétegű sejtkultúrára 2 ml olyan réteget rétegeztünk, amelyet agarmentes plakk közeges kétszer vizsgálandó vegyü- 50 let és egy olyan plakk közeg egyenlő arányban való összekeverésével állítottunk elő, amelyet EMEM és 50 jjLg/ml penicillin G, 50 jig/ml srreptomicin szulfát, 0,002% DEAE Dextran, 30 mmól magnézium-klorid és 0,7% Jonagan (Oxoid, USA Inc. Columbia, MO) ke- 55 verőkéből kaptunk. A 9-(5,5,6,6-tetrahidro-5,6-didezoxi-ß-D-ribohexofuranozü)-9H-purin-6-amin vizsgálandó vegyületre vonatkozó IC50 érték 0,05 |imól, szemben a virazolra vonatkozó 76,6 pjnólos értékkel. S7ABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) általános képletű adenozin származékok—ahol V jelentése oxigénatom, Rj jelentése etinil-vagy ciano-csoport, A2 jelentése hidroxü-csoport, Y2 és Y3 jelentése nitrogénatom, Q jelentése -NH2, — és gyógyász&tüag alkalmazható savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (XX) általános képletű aristeromidn/adenozin származékot - - ahol V, Rj, A^ Y2, Y3 és Q jelentése a fenti, O® jelentése védett hidroxü-csoport, A2b jelentése védett b idroxil-csoport — egy savval kezelünk és a kapott vegyületet kívánt esetben gyógyászatiéig alkalmazható sóvá alakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás Rj helyén etinflcsoportot tartalmazó vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az Rí helyén etinil-csoportot tartalmazó vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás 9-(ß-D-ribufura- 60 no-nitrü)-9H-purin-6-amin előállítására, azzal jelle-7
