203557. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászatilag aktív foszfino-szénhidrogéncsoport (VIII) csoporthoz tartozó fémekkel képzett komplexeit tartalmazó tumorellenes készítmények előállítására
1 HU 203 557 B 2 inert gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítót tartalmaznak, és ahol a készítmények hatásosan meggátolják a hatóanyagra érzékeny állati tumorsejtek növekedését, és hatóanyagként valamely (I) általános képletüvegyületet alkalmazunk. in vitro citotoxicitás A fémkomplexek citotoxikus hatását in vitro értékeltük ki B16-F10 patkány melanoma sejteken és HCT116 emberi vastagbél karcinoma sejteken. A B16-F10 sejtvonalat Eagle’s Minimum Essential Medium (MeM) tenyészetbe ntartjuk, amely Earle féle sókat (Gibco) tartalmaz 2 mmól L-glutaminnal, 2,06 mmól pirószollósav-nátriumsóval, 0,26 egység/ml penicillinnel, 100 egység/ml, ill. 100 p.g/ml penicillin/sztreptomicinnel és MEM nem esszenciális aminosavakkal (0,6% Gibco) és 10% magzati marhaszérummal (Hyclone) dúsítva. A HCT-116 sejteket McCoy féle 5A táptalajon tenyésztjük (módosított Gibco), melyhez még hozzáadunk 2 mmól L-glutamint, 0,12 mmól L-szerint és 0,17 mmól aszparagint, 1,5 mmól piroszölősav-nátriumsót, 0,6% Gibco MEM nem vitaminokat, és magzati borjúszérumot (10% Hyclone), valamint 100 egység/ml és 100 p.g/ml peni/. cillin/sztreptomicint. Mindkét sejtvonalat 37 "C-on inkubáljuk 5%-os széndioxidot tartalmazó levegőben nagy nedvességtartalmú inkubátorban. A logaritmikusán növő sejteket enyhe tripszinezés- 5 sei gyűjtjük össze és 4000 sejtet adunk a 96-üregű mjkrotiter lap (Costar) mindegyüc üregébe. A lemezeket 37 *C-on 5%-os szénhidoxidban inkubáljuk egész éjjel, és hagyjuk, hogy a sejt a lemezhez kapcsolódjon. Ezután a sejteket fémkomplexszel vagy ciszplatinnal 10 kezeljük és 72 óra hosszat inkubáljuk. A lemezeket felfordítjuk és a táptalaj, a hatóanyag és a levált sejtek eltávolítása céljából rázzuk. Hozzáadunk 10%-os formaiint foszfáttal pufferezett sóoldatban és a sejteket 10 percig fixáljuk. A fixálószert eltávolítjuk, a lemeze- 15 két levegőn szárítjuk, 0,075%-os kristály ibolyával 15 percig megfestjük, kétszer mossuk és levegőn szárítjuk. A festéket 0,2 ml 0,1 mólos ecetsav és etanol 1:1 arányú elegyével oldjuk és az optikai sűrűséget Dynatech MR600 mikrotiter lemezolvasóval határozzuk eg. 20 Az IC 50 értékeket az abszorpciós adatok lineáris regressziós adatainak analízisével számítjuk ki. Az in vitro citotoxicitás teszt eredményeit több vegyületre vonatkozólag az 1. táblázat mutatja be. Képletszám Vegyületszám Dl D2 A XI X2 n Y M IC 50 (mcg/ml) B16 HTC116 5 TN0354 P P (CH2)2 n N03 Ni(ü) 4,1 1,3 a) a sejt növekedést 50%-kal csökkentő koncentráció Patkány leukémia elleni hatás Valamennyi fémkomplexet vizsgáltuk P388 patkány leukémia tumorellenes hatásra. Egy-egy kiválasztott vegyületet megvizsgáltunk L1210 patkány leukémia elleni tumorellenes hatásra. Néhány kiválasztott vegyületet megvizsgáltunk a ciszplatinra rezisztens L1210 patkány leukémia elleni antitumor hatás- 40 ra, és az L1210 patkány leukémia egy szubvonalára gyakorolt tumorellenes hatásra is. (L1210:DDP). 20 g súlyú CBFj egereket beoltunk intraperitoneálisan 10° P388 leukémia, L1210 leukémia vagy L1210:DDB leukémia ascites sejtekkel, a teszt rendszertől függően. 45 A gyógyszeradagolást a tumorbeépítés utáni napon kezdtük valamennyi tesztrendszerben. A komplexeket különböző dózisszinten adagoltuk, intraperitoneális injekcióval. 4-6 egérből álló csoportokat használtunk minden dózisszinten és ezeket csak az első napon 50 kezeltük a komplexszel 10 fiziológiai sóoldattal kezelt kontroll egérből álló csoportot is használtunk minden kísérletnél. Pozitív kontrollként minden kísérletben egy-egy ciszplatinnal kezelt csoportot alkalmaztunk. Az egereket a kezelés előtt lemértük, az ötödik vagy 55 hatodik napon ismét lemértük és a toxicitás mértékéül szolgált az átlagos súlyváltozás. Mortalitás szempontjából naponta megfigyeltük az állatokat, és kísérleteket 30 nap múlva fejeztük be. Az antitumor hatást a T/C %-ra alapítva határoztuk meg. A T/C % a gyógy- 60 szerrel kezelt csoport átlagos túlélési ideje a fiziológiailag kezelt kontrollcsoport átlagos túlélési idejéhez viszonyítva szorozva 100-al. A fiziológiai sóval kezelt egerek átlagos túlélési ideje általában 9 nap P388 leukémia esetén, és 7 napos az L1210 és az L1210DDP leukémia esetén. A komplexet akkor tartjuk hatásosnak, ha a T/C% értéke 125. A n. és Ha. táblázatok a patkányleukémia elleni antitumor hatás kiértékelését tartalmazzák, az egyes vegyületeknél megadtuk az elért maximális T/C %-ot és azt a dózist, amely ezt a hatást kiváltotta. B16 melanoma elleni hatás AB16 malanoma ellen számos fémkomplexet értékeltünk ki antitumor hatásra. Csoportonként 10 EDF j egeret beoltottunk intraperitoneálisan 0,5 ml 10 tömeg/térfogat%-os B16 melanoma kásával. Az intraperitoneális kezelést a fémkomplexekkel az implantálás után egy nappal kezdtük meg, és összesen 9 napig naponta folytattuk. 4-5 dózist teszteltünk minden vizsgált vegyület esetében. Minden kísérletnél beiktattunk egy fiziológiai sóoldattal és egy ciszplatinnal kezelt kontroll csoportot. Az egereket naponta megfigyeltük túlélés szempontjából, és 60 nap múlva fejeztük be a kísérleteket. A fiziológiai sóoldattal kezelt kontroll egerek átlagos túlélési ideje 20-26 nap. A gyógyszerrel kezelt átlagos túlélési idő a kontrolihoz képest a 4
