203373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás HIV-ellenes aktivitással rendelkező heparin előállítására
1 HU 203 373 B 2 A találmány HTV-ellenes hatással rendelkező heparin frakció elkülönítésére és ebből a HÍV-ellenes aktivitású heparin előállítására vonatkozik. Az így kapott heparin humán immunelégtelenséget okozó vírus elleni aktivitással rendelkezik, így az AIDS kezelésére alkalmazható. Jelenleg nagy volumenű kutatás folyik a vírusfertőzések emberben és állatban való kezelésére és gyógyítására irányuló módszerek kidolgozására. Az AIDS és az ARC gyakorisága emberben ugyanis riasztó sebességgel nő. Az AIDS-betegek esetében fennálló 5 éves túlélési arány lehangoló, ezenkívül az AIDS-betegek, akiknek immunrendszerét a fertőzés komolyan károsította, számos esetleges fertőzésben szenvednek, amilyen a Kaposi-szarkóma és a Pneumocystis caminii által okozott pneumónia. Az AIDS gyógyítására nem áll rendelkezésre eljárás, a jelenleg alkalmazott kezelési módszerek pedig többnyire nem rendelkeznek megfelelő bizonyítékkal a hatékonyságot illetően és számos nem kívánt mellékhatással járnak. A betegségtől való félelem társadalmi méretű elutasítást és diszkriminációt eredményez azok iránt, akik betegek vagy feltehetően ebben a betegségben szenvednek. A retrovírusok az RNS (ribonukleinsav) vírusok egyik osztályát alkotják, amelyek reverz transzkriptáz segítségével replikálódnak. Ennek során egy komplementer DNS (cDNS) szál képződik és erről állítja elő a vírus a kétszálas provirális DNS-L Ez a provirális DNS statisztikus eloszlásban épül be a gazdasejt kromoszóma-DNS-ébe. így válik lehetővé a vírus replikációja, a vírus genomot tartalmazó integrált DNS további transzlációja révén. Az ismert retrovírusok között számos olyan található, amely onkogén vagy tumorkeltő. Az első két felfedezett humán retrovírusról - ezeket „humán T-sejt leukémia vírus F-nek vagy HTLV-I-nek és HTLV-II-nek nevezték el - ténylegesen megállapították, hogy a T-limfociták megfertőzése után szórványosan leukémiát okoznak emberben. A harmadik ilyen felfedezett humán vírusról - a HTLV-ni-nól, amelyet újabban HIV-nek neveznek - azt találták, hogy a T-limfociták megfertőzése után sejtpusztulást okoz. Ezt a vírust úgy azonosították, mint a szerzett immun-elégtelenségi szindróma (AIDS) és az AIDS-szei összefüggő komplex (ARC) kórokozóját. A HÍV burok-fehérjéje egy 160 kDa molekulatömegű glikoprotein. Proteázzal ez a fehérje egy 120 kDa molekulatömegű külső fehérjére - gp 120 - és egy transzmembrán glikoproteinre-gp41 - bontható fel. Agp 120 jelű fehérje tartalmazza azt az aminosav-szekvenciát, amely felismeri a receptort a CD 4-pozitív humán T-segédsejteken. Újabb irodalmi közlemények szerint egyes poliszulfatált poliszacharidok, mint a dextránszulfát, a tengeri algák karrageninjei, a pentozán-poliszulfát és a heparin a HIV-1 replikádé specifikus in vitro inhibitorai; ld. a következő helyeket- M. Ito et al., Antiviral Res. 7, p. 361-367,1987;- Baba et al., Antiviral Res. 9, p. 335-343,1988;- O. Yoshida, Biochem. Pharmacol. 37, p. 2887-2981, 1988;- R. Ueno és S. Kuno, Lancet 1, p. 1379,1987. Ennek az aktivitásnak a mechanizmusát Baba et al. vizsgálták (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, p. 6132- 6136,1988). További újabb közlemények arra mutatnak, hogy a gp 120 307-330 és 303-321 aminosav-maradékának megfelelő szintetikus peptidek antiszérumai gátolják a HÍV által indukált szincitium-képződést:- Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, p. 2898-3202,1988 és- hdker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, p. 1932-1936,1988. A HIV gp 120-ban a 303-330 maradékokhoz való antitestkötődés nyilvánvalóan a vírusnak a CD 4 receptorhoz való kötődését és a plazma-membránnal való egyesülést befolyásolja. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a heparinból, mely egy szulfátéit poliszachirid „HIV-ellenes heparinnak” nevezett frakció állítható elő oly módon, hogy a heparint hozzákapcsoljuk egy pepiidhez, amely a HÍV gp 120 protein 301-324 maradékának felel meg. Megállapítottuk, hogy a HTV-ellenes heparin aktivitása szignifikánsan magasabb - a nem frakcionált szulfátéit poliszacharidéhoz képest - a szincitum-képződés és a P24 mag-vírusantigén képződése, ill. megjelenése gátlása vonatkozásában HIV-fertőzött CD 4 sejteket tartalmazó táptalajban és lényegesen csökkenti a HÍV fertőzőképességét. A találmány szerinti eljárással előállított HIV- ellenes heparin az AIDS és az ARC kezelésében használható. A gp 120 peptid-fragmentumot a szokásos affinitáskromatográfiás eljárás keretében alkalmazzuk a HIV-ellenes heparin frakció elkülönítésére. A találmány tárgya tehát a következőkben foglalható össze: a nyers heparint affinitáskromatográfiának vetjük alá egy gyantához kötött (I) képletű NNTRKSKIQRGPGRAFVITGKIG (I) peptid (RP135) alkalmazásával. Az a szulfátéit poliszacharid frakció, amely a gyantához kapcsolt RP135 pepiidhez kötődik, felhasználható a szincitium-képződés megelőzésére HIV-vel fertőzött CD 4* sejtekben és csökkenti a HÍV fertőzőképességét. Az ábrák magyarázata a következő. 1. ábra. Kereskedelmi heparin készítmény (163 p/mg, USP) frakcionálása RP135-AffiGel-10-en. 200 mg (száraz tömeg) kereskedelmi minőségű heparint (HEPAR Industries) viszünk fel egy peptid-oszlopra (ágytérfogat 1 x 10cm), amelyet lOmMHepespufferrel (pH 7,4; 0,05 M NaCl) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot intenzíven mossuk a meg nem kötött vagy nem reakcióképes heparin (URH) eltávolítására. 1 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopot ezután a kiegyensúlyozáshoz használt, 1 M NaCl-t tartalmazó pufferrel eluáljuk (nyíl) az RP135-höz kötött magas reakcióképességű heparin (HRH) előállítására. A heparint turbiditás-méréssel mutatjuk ki, a protamin-szulfát vizsgálat (kitöltött kör) segítségével (M. W. C. Hatton et al., Thromb. Rés. 13, p. 655-657,1978). A vizsgálat menete röviden a következő: A különböző frakciókból 10 pl-t összekeverünk 100 pl, 1 mg/ml töménységű vizes protamin-szulfát oldattal, majd a mintához hozzáadunk 240 pl puffert, amelyet az oszlop kiegyensúlyozásához használtunk. Az 1M NaCI-t tartalmazó pufferrel eluált frakciók vizsgálatához 100 pl mintát 250 pl, 1 mg/ml töménységű protamin-szulfát oldattal keverünk össze. A zavarosságot 420 nm-en mérjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
