203371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új inzulin-származékok és az azokat tartalmazó injekciós oldatok előállítására
9 HU 203 371 B 10 GlnAI7ArgB273(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ból, ArgBZ73(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-2 l)-ből, LysB273(1-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1 -21 )-ből és HisA2l,ArgB273(l-29)-A]a-Ala-Lys-A(l-21)-ből kiindulva állítjuk el<5. 5 A kapott termiek hozamát, a humán inzulinétól eltérő töltések számát, a pH = 8,9-nél végzett DISC PAGE elektroforézis során mutatott, az inzulinhoz viszonyítottt migrációs sebességet, és a humán inzulintól eltérő aminosav-összetételt az I. táblázatban adjuk meg. 10 7-13. példa Az Aspé21 Arg“7,ThrB30-NH2 humán inzulin, GlytítArtfZ7Jkr*30-NH2 humán inzulin, HúP,Ar fIr,ThrB30-NH1 humán inzulin, 15 GlyA2,ArgB”,GlnBa,Thrjao-NH2 humán inzulin, SerÁ2lAr?27,GlnB,3,ThrB30-NH2 humán inzulin, Thr*2,MfZ7,GlnBI3,ThrB30-NH2 humán inzulin és Ser*11 Arg“7,ThrB30-NH2 humán inzuUn előállítása ' A cím szerinti hét vegyületet a megfelelő, egyetlen 20 láncból álló inzulin prekurzorból, vagyis az AspA21,ArgB273(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ből, GlyAa^rgB273(l-29)- Ala-Ala-Lys- A(l-21)-ből, HisA2l^rgB273(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ből, GlyAa^rgB27,GlnBn3(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ből, 25 SerA21/Lrg®Z7,GlnB133(l-29>Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ból, ThrA2l,ArgB27,GlnB133(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-bőlés SerA21,ArgB273(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1 -2 l)-ből kiindulva, vizes szerves oldószeres oldatban, treonin- 30 -amid jelenlétében végzett, tripszinnel katalizált transzpeptidálási reakcióval álh'tjuk elő, amint ezt a 194 864 számú közzétett európai szabadalmi leírás 4. és 6. példája leírja. A kapott termékek hozamát, a humán inzulinétól 35 eltérő töltések számát, a pH = 8,9-nél végzett DISC PAGE elektroforézis során mutatott, és a humán inzulinéhoz viszonyított migrációs sebességét, valamint a humán inzulintól eltérő aminosav-összetételt az I. táblázatban adjuk meg. 40 14. példa Az Asff2' Arg827Í.y&30-NH2 humán inzulin előállítása A cím szerinti vegyületet a megfelelő, egyetlen láncból álló inzulin prekurzorból, vagyis az Asp*21, ArgB273(l- 29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ből állítjuk elő, mégpedig szerves oldószeres és vizes oldatban, Lys(Boc)-NH2 jelentőiében, tripszin katalízissel végzett transzpeptidálási reakcióban, majd a köztitermékként kapott Lys(Boc)B3°NH2 humán inzulint megtisztítjuk, és trifluor-ecetsavval lehasítjuk a tercier-butoxi-karbonil-csoportot, amint ezt a 194 864 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés 5. és 7. példája leírja. A kapott termék hozamát és analitikai adatait az I. táblázatban adjuk meg. 15. példa Az (I) általános képletü vegyületeket tartalmazó injekciós oldatok előállítása A nyújtott hatás időtartamának meghatározása céljából az (I) általános képleté vegyületekből steril injekciós oldatokat készítünk, ehhez izotóniás szerként 1,6 vegyes%-os glicerint, konzerválószerként 03 vegyes%-os m-krezolt használunk, és az okiatokat 0,01 mólos nátrium-acetáttal pufferoljuk. A cink-ionok koncentrációja 8 pg/ml vagy 80 ttg/bil. Az oldatok pH-értékét úgy állítjuk be, hogy kelléképpen távol legyenek az (I) általános képleté vegyületek izoelektromos pontjától, és így az oldatok még 4 *C hőmérsékleten való tárolás során is tiszták maradnak. Az oldatokban az (I) általános képleté vegyületek koncentrációja: 240 mól/ml. Ezt a 240 nmól/ml-es koncentrációt úgy májük meg, hogy egy m-krezolt nem tartalmazó, a fentinél töményebb törzsoldat abszorpcióját 276 nm hullámhossznál mérjük, e származékráchoz a sertés inzulin moláris extinkciós koefficiensét (6100) használjuk [lásd: Handbuch der Inneren Medizin (Belgyógyászati kézikönyv), 7 (2A), szerkesztette: Oberdisse (1975), 113. oldal]. Az egyetlen összetevőből álló sertés inzulinra megállapított hatás: 283 egység/mg száraz anyag [lásd: Diabetes Care (Acukorbetegség gyógyítása), 6 (1. I. táblázat Helyettesítés a humán inzulinban Hozam, % A töltések száma a humán inzulinhoz képest, pH = 7-nél Migrációs sebesség pH = 8,9-nél, a humán inzulin migrációs sebességének %-ában kifejezve Az aminosav-összetétel eltérései a humán inzulinétól, savas hidrolízis után meghatározva csoport/molekula GlnB13,GlnA17 46 +2 55 nincs GlnA17,ArgB27 32 +2 55 +1 Arg,-1 Thr Arg*27 35 +1 75 +1 Arg, -1 Thr Lys827 39 +1 75 +1 Lys, -1 Thr His^.Arg827 lé + 1.1 75 +1 His, +1 Arg, -1 Asp,-1 Thr Asp*21 ,ArgB27,ThrB30-NH2 23 +1 75 +1 Arg,-1 Thr GlyA21,ArgB27,ThrB30-NH2 32 +2 55 +1 Gly, +1 Arg, -1 Asp, -1 Thr HisA21,ArgB27,ThrB30-NH2 20 +2.1 55 +1 His, +1 Arg, -1 Asp,-1 Thr GlyA21,ArgD27,GlnB13,ThrB30-NH2 23-f3 35 +1 Gly, +1 Arg, -1 Asp, -1 Thr SerA21,Arg827,GlnB,3,ThrB30-NH2 21 +3 35 +1 Ser, +1 Arg, -1 Asp, -1 Thr ThrAa,ArgB27,GlnB13,ThrB30-NH2 29 +3 35 +1 Arg,-1 Asp SerA21,ArgB27,ThrB30-NH2 +2 55 +1 Ser, +1 Arg, -1 Asp, -1 Thr Asp*21 ArgB273ysB30-NH2 13 +2 55 +1 Arg, +1 Lys, -2 Thr 6
