203371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új inzulin-származékok és az azokat tartalmazó injekciós oldatok előállítására
5 HU 203 371 B 6 Amint ez a szakirodalomból ismeretes, a humán inzulinnak nem valamennyi aminosava feltétlenül szükséges az inzulin-hatás kifejtéséhez. Valóban, a sertés és szarvasmarha eredetű inzulint, amelyek bizonyos aminosav-összetevői eltérnek a humán inzulin megfelelő összetevőitől, alkalmazták a cukorbetegek kezelésére. A különböző fajokban megtalálható inzulin molekulák számottevő mértékben eltérnek egymástól. így például, a humán inzulin molekulájában jelenlevő számos aminosavat más aminosavval helyettesíthetünk, anélkül, hogy kedvezőtlen mértékben csökkentenénk az inzulin-hatást, ilyen kicserélhető aminosavak például a molekula izoelektromos pontját befolyásoló aminosavak is. Nyilvánvaló, hogy az E\ E2, E\ E4, R, W, X és Y helyén szereplő csoportokat úgy választjuk meg, hogy az így kapott (I) általános képletű vegyidet gyógyászatiig elfogadható legyen. Az ismert, kétfázisú inzulin-készítményekben szokásos a gyors hatású, oldható inzulint a nyújtott hatású, kristályos inzulinnal kombinálni ugyanabban az injekciós készítményben. Ha a jelen találmány szerinti (I) általános képiéül vegyületeket használjuk, akkor egyetlen, (I) általános képletű vegyület oldatának alkalmazásával ugyanígy kombinált hatást, mégpedig a rövid hatás és a nyújtott hatás kombinációját érhetjük el. A rövid hatás és a nyújtott hatás aránya csökken, ha a cink-ionoknak az oldatban való koncentrációját növeljük. Az (I) általános képletű vegyületeket egy transzpeptidálási reakcióval állíthatjuk elő oly módon, hogy valamely, az inzulin diszulfid-hídjait a megfelelő helyen tartalmazó bioszintetikus prekurzort (az inzulinnak az élő szervezetben való felépítése során köztitermékként keletkező vegyületet), mégpedig a (II) általános képletű, ahol Q jelentése egy q darab aminosavból álló peptidlánc, ahol q jelentése 0-33-ig terjedő egész szám lehet, T jelentése lizin vagy arginin, r jelentése 0 vagy 1, és E1, E2, E3, E4, W és X jelentése a fenti, vegyületet tripszin vagy egy tripszin-aktivitásű enzim mint katalizátor jelenlétében, víz és egy szerves oldószer elegyében, a 4 343 898 számú amerikai szabadalmi leírásban leírttal analóg módon egy (III) általános képletű, ahol X és R jelentése a fenti, továbbá, ahol az Y csoportok oldalláncában szereplő aminocsoportok és hidroxilcsoportok adott esetben az aminocsoportok és hidroxilcsoportok védésére alkalmas védőcsoportokkal védve vannak, amino-vegyülettel reagáltatunk, majd a védőcsoportokat lehasítjuk. A (II) általános képletű vegyületeket kifejezhetjük valamely gazdaszervezetben, például egy élesztőben, a 163 529 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi leírásban leírthoz ltasonló módon, és ehhez egy olyan gént használunk, amely a szóban forgó aminosavak helyes kódrendszerét tartalmazza. Az új inzulin-származékot kódoló gént ezután bevisszük egy megfelelő expressziós vektorba, amelyet beviszünk egy olyan élesztőbe, amelyben a kívánt vegyület expressziója lehetséges. Ezután a terméket kifejezzük, majd a sejtekből vagy a táptalajból elkülönítjük, attól függően, hogy a termek kiválik-e a sejtekből vagy nem. Az aminocsoportot megfordítható módon védő védőcsoport például a tercier-butoxi-karbonil-csoport, és a hidroxilcsoportot megfordítható módon védő védőcsoport például a tercier-butil-csoport. Az ilyen csoportokat olyan körülmények között távolítjuk el, amelyek között az (I) általános képletű vegyület nem szenved nem-kívánatos változást, e célra alkalmas reagens például a triliuor-ecetsav. Az A17-, A21-, B13- vagy B27-helyzetbe a humán inzulintól eltérő aminosav-összetevőket kényelmesen beépíthetjük génsebészeti úton, és a tripszinnel katalizált félszintetikus úton visszük be a B-lánc kívánt C-terminálisán szereplő csoportok Az (I) általános képletű új vegyületek előállítása során a humán inzulinhoz képest további pozitív töltéseket az inzulin molekulájának 51 aminosavból álló aminosav-készletébe visszük be, és nem pedig oly módon, hogy az emlősökből származó inzulinok B-láncát az eredetileg benne levő 30 aminosav-egységen túl meghosszabbítjuk. E módszernek az az előnye, hogy könnyebb az ilyen vegyületeket elkészíteni. A félszintetikus transzpeptidálás során az aminosav-amidot vagy aminosav-észtert molárisán nagy fölöslegben alkalmazzuk. Ha a transzpeptidálási reakcióban egy dipeptid-amidot vagy dipeptid-észtert kellene használnunk, akkor e reagenseknek vagy az ára, vagy oldhatósága megnehezítené a nagy fölöslegek alkalmazását, és ennek következtében a termék hozama alacsonyabb volna. Még abban az esetben is, ha a transzpeptidálási reakció során, hasonló körülmények között például a Lys(Boc)NH2 vagy a Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 molárisán azonos fölöslegét használjuk, az aminosav-amiddal lényegesen magasabb hozamot érhetünk el, mint a dipeptid-amiddal. A jelen találmány szerinti inzulin-készítményeket úgy állítjuk elő, hogy az (I) általános képletű vegyületet enyhén savas körülmények között vizes közegben feloldjuk, például 240 nmól/ml és 600 nmól/ml közötti koncentrációban. A vizes közeget például nátrium-kloriddal, nátrium-acetáttal vagy glicerinnel tesszük izotóniássá (a vérrel azonos ozmózisnyomásúvá). A vizes közeg tartalmazhat továbbá cink-ionokat, mégpedig az (I) általános képletű vegyület 1 nmól-jára számítva legfeljebb körülbelül 30 |tg kétértékű cink-iont, továbbá pufffer-anyagokat, például acetátot, nitrátot vagy hisztidint, valamint konzerválószereket, mint például m-krezolt, nipagint vagy fenolt. A végeredményképpen kapott inzulin-készítmény pH-értéke az (I) általános képletű vegyületben szereplő, és a humán inzulinhoz képest megváltoztatott töltések számától, a cink-ionok koncentrációjától, az (I) általános képletű vegyület koncentrációjától, valamint attól függ, hogy melyik konkrét (I) általános képletű vegyületet alkalmazzuk. A készítmény pH-érlékét az adagolás szempontjából előnyösre, például 2,5 és 4,5 közé álhtjuk, hogy így meggátoljuk az oldott anyagok kicsapódását. Az inzulin-készítményt steril szűréssel sterilezzük. A jelen találmány szerinti inzulin-készítményeket az ismert inzulin-készítményekhez hasonló módon használjuk fel. A találmány szerinti készítmények bármely új jellemző vonását, vagy e jellemző vonások kombinációját lényegesnek tekintjük a jelen találmány szempontjából. A jelen leírásban az aminosavak jelölésére ugyanazokat a rövidítéseket használjuk, mint az alábbi közleményben: J. Bioi. Client., 243, 3558 (196S). A jelen leírásban megadott aminosavak L-konfigurációjúak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
