203367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropinok kinyerésére híg vizes oldatból
HU 203367B hetővé vált a kicsapás százalékos meghatározása. Átmeneti fémek sóiként cink-kloridot, magnán(H)-kloridot és réz(II)-kloridot használtunk. Minden sóból 24 mmólos, 2,4 mmólos és 0,24 mmólos oldatot készítettünk. Pozitív kicssapó kontrollként 20%-os triklór-ecetsav-oldatot használtunk. A fémsókat vagy a triklór-ecetsav-oldatokat a pST-t tartalmazó vizes oldatokhoz adtunk, és a kicsapást keverés közben, szobahőmérsékleten, egy órán át végeztük. Akicsapott anyagot 15 000 g-n 10 percig, szobahőmérsékleten centrifugálva szemcséztük. A dupla csövekben lévő felülúszóból 0,5 ml-es részleteket vettünk ki, és polipropilén csövekben számláltuk a beütéseket. A minimális beütésszám a háttérének négyszerese volt. A szemcseképződést vizuálisan vizsgáltuk. A kísérleti eredmények az 1. példá ban kapottakhoz hasonlóak voltak. 9. példa A kicsapott pST oldhatósága és bioaktivitása A kicsapási kísérlethez 500 mg, a 8, példa szerint előállított pST-t 50 ml ionmentes vízzel (dH20-val) elegyítettük. Az anyagot 7,4-es pH-jú pufferrel szemben extenzíven dializáltuk, és az oldat 1500 g-n szobahőmérsékleten végzett centrifugálás hatására kitisztult. A semleges pST oldatból 10 ml-es részle leket vettünk ki, amelyeket azonos térfogatú 2,4 mmólos cink-klorid vagy 2,4 mmólos réz(II)-klorid oldattal elegyítettünk. Ä szuszpenziókat egy órán át szobahőmérsékleten kevertük, majd 30 percig, 15 000 g-n centrifugálva szemcséztük. Minden szemcsét - 80 °C-on megfagyasztottunk, és 20 ml, semleges pH-jú pST oldatból ionmentes vízzel 50%-osra való hígítás után kapott, fagyasztott kontroll múltával párhuzamosan liofüizáltuk. A liofüizált mmták száraztömegét és százalékos tisztaságát meghatározva következtettünk minden kicsapási eljárásnak a liofilizáiásos kezeléshez viszonyított hatékonyságára. A fémsóknak a pST bioaktivitására gyakorolt ha - tásának meghatározására a 3. példában leírtakhoz hasonlóan növekedési kísérleteket végeztünk olyan patkányokkal, amelyeknek hipofízisét eltávolítotíuk. A kísérletekhez a vizsgálat megkezdésekor 36 napos olyan nőüstény patkányokat használtunk, amelyek hipofízisét eltávolítottuk, és az állatokat tizes csoportokba osztottuk. A csoportosítást tömeg szerint végeztük úgy, hogy az átlagos kiindulási tömeg minden csoportban közel azonos volt. Minden patkánycsoporthoz rendeltünk egy kezelést. A patkányok minden nap, küenc napon át szomatotropin vagy kontroll oldatot kaptak szubkután injektálva. Az injektálás a koponya alá, a lapocka alatti terület közelében történt. A szomatotropin szolubilizálásáraakövetkezőParlowpuffer-oldatokat használtuk: I. NaHCOa (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 10,8-re állítva. H. NaHCOs (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 9,5-re állítva. A pST ismert mennyiségét 10,8-es pH-jú pufferben oldottuk, az oldat pH-ját 2 n sósavval 9,5-re állítottuk be, és a térfogatot 9,5-es pH-jú pufferrel a kí13 vánt értékre egészítettük ki. Egy 10 patkányból álló csoport szolgált negatív kontrollként, és ezeknek az állatoknak a szomatotropin oldására használt hordozót adtuk injekció formájában. Egy második csoport liofüizált sertés szomatotropin oldatot kapott.Á további csoportoknak a találmány szerinti, átmeneti fémmel kicsapott pST kiválasztott dózisainak oldatát adtuk injekció formájában. A patkányokat az 1., 2., 9. és 10. napon mértük és a testömegüket feljegyeztük. A vizsgálati időszak végén, a 10. napon a patkányok tömeggyarapodására vonatkozó adatokat analizáltuk. 10. példa E.co/i'HBlOl táptalajban való fermentálásával 43 liter tisztított A7rpST-oldatot kapunk 60 mM-os etanol-amin pufferben, amelynek pH-ja 9,0, koncentrációja 590 mg/ml volt. Az oldatot körülbelül 810 mg/liter töménységűre koncentráltuk egy keresztáramú ultraszűrő egységben (Romicon HF), amely egy 73,6 literes membránbetéttel volt ellátva, és a betét névleges molekulatömeg áteresztő képessége megközelítőleg 5000 dalton volt. A kapott tömény, etanol-amin puff erben lévő és 9-es pH-jú termék-oldatot ugyanezen ultraszűrő egységben 50%os karbonát puffer (0,21 mmól Na2CO; 0,25 mmól NaHC03) hatszoros térfogatával szemben dializáltuk pH 8 és 10 között. A kapott visszamaradó termék, mostmár 50%-os karbonát pufferben és 8,0 feletti pH-n kissé opálissá vált (ODs95- 0,01) és egy Amicon DC-10 keresztáramú mikropórusos szűrő egységben tisztult ki ismét, amely egy 0,1 p,m pórusméretű, 0,45 m -es membrán betéttel volt ellátva. A fenti kitisztult oldatot (26 liter, 800 mg ST/ml koncentráció és 9,0 pH) óvatosan kevertük és 3,7 liter 0,2 p-os szűrőn 2,4 mmólos cink-klorid oldatta! elegyítettük olyan tempóban, hogy az adagolás 5- 30 perc alatt fejeződjön be. A Zn2+ hozzáadott mennyisége következtében ebben a kísérletben a Zn/ST mólarány megközelítőleg 10 volt. Mielőtt a Zn-A7rpST csapadékot elkülönítettük volna, az elegyet még 20 percig kevertük. A kapott Zn-A7rpST szuszpenziót, amelynek a koncentrációja most 0,08% volt és a részecskék mérete 2-5 pm, egy 0,1 p-os membránú mikropórusos szűrőegységben körülbelül 2 -5%-osra töményítettük. A kapott szuszpenziót körülbelül 250 000 mg/1 koncentrációig töményítettük osztatlan forgórészű készülékben való folyamatos centrifugálással. A szuszpenziót más esetben lehet közvetlenül permetezve szárítani vagy körülbelül 100 000 mg/1 koncentrációig töményíteni keresztáramú mikropórusos szűrő segítségével vagy centrifugálással. A visszamaradó pasztát aztán körülbelül 2 cm-es rétegben kiterítettük és két napig fagyasztva szárítottuk maximálisan 25 °C termékhőmérséklet mellett. A fagyasztva szárított anyag, amelyben a részecskék mérete általában 10-200 pm, és a térfogatsűrűsége megközelítőleg 0,5, alkalmas az adagoló rendszerbe való közvetlen bevezetésre. 11. példa A10. példa szerint jártunkéi, azonban az 50%-os karbonát puffert 2 mM-os Trisz pufferrel helyette14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
