203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 lított hibrid interferonok termostabilitása magasabb, mint a LyIFN-a-2 interferoné és a hibrid interferoné. Azaz az a hőmérséklet, amelynél a víruseUenes aktivitás 50%-a elvész (az IFN oldat hőmérséklet-növekedése 1 °C/perc), 62,8 °C a LyIFN-a-2 esetében és 63 °C a ,3iB2D3D4” hibrid interferon esetében, míg a ,3iD2D3D4”, ,3iD2B3B4”, 31D2B3D4” és hibrid interferonoknál a megfelelő érték 65 °C, 64,7 °C, 65,3 °C, illetve 64,2 °C. A hibrid interferonok biológiai tulajdonságai és gyógyszerkészítmények A jelen találmány szerinti eljárással előállítható hibrid interferonok olyan előnyös biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, hogy emiatt értékes gyógyszereknek minősülnek. A találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok igen hatásos vírusellenes aktivitásukkal tűnnek ki emlős sejtek esetén, ilyenek a bovin és főleg a humán sejtek. A vírusellenes titerek, amelyeket a citopátiás hatás redukciójával, S. Rubinstein és munkatársai módszere szerint [J. Virol., 37, 755 (1981); bovin (MDBK) és humán (WISH) sejtek ráfertőzése vezikuláris stomatitis vírussal (VSV) történik] határoztuk meg a következőképpen; I. táblázat Hibrid interferonok vírusellenes titerei VSV-t használva ráfertözö vírus gyanánt Interferon Specifikus aktivitás/mg protein bovin humán ,3iD2D3D4 1.25-108 1.3-108 .31D2B3B4” 1.25-108 1,3-108 ,3iB2D3B4 9,5 x 107 >2-108 ,31D2B3D4” 1,9 xlO8 7.7-107 ,3iD2D3B4 7,2-107 3.8-107 .31b2b3d4” 1.05-108 8-107 „D1D2B3B4”(DB) 8.5-107 3.3-105 ,31B2D3D4”(BD) 1.15-108 2.33-108 a-2 (,3”) 1.05-108 2,1310s a-3 („D”) 5.5-107 6,7-106 A találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok vírusellenes aktivitása nemcsak humán sejtekre korlátozódik, hanem mindig interspecifikusak. A ,3iD2D3D4”, ,3iD2B3B4”, -3.B2D3B4”, ,3iD2B3D4” és ,3iB2B3D4” hibrid interferonoknak a humán sejtekre gyakorolt vírusellenes hatása hasonló fokú, mint az eredeti a-2 interferoné és a ,3iB2D3D4” interferoné, amely szoros rokonságban van a 4414150 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szereplő ,3D” hibrid interferonnal, de jelentősen nagyobb a hatásuk (10-30-szoros), mint a ,JD1D2B3B4" referens hibrid interferonnak (230-600- szoros). A humán sejtekre kifejtett általános vírusellenes hatástól eltekintve, a találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok a célsejtek sokkal specifikusabb válaszát idézik elő. így tehát számos intracelluláris enzim indukálódik, az interferon hatására. Ezek közt az enzimek közt van a (2’-5’) oligo-izoadenilát szintetáz („2-5 A szintetáz”), amely a (2’-5’) kötésű oligonukleotidokat hozza létre és ezek ezután egy olyan latens endoribonukleázt aktiválnak, mely a vírus mRNS-t hasítja. Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok, így a ,31D2D3D4”, ,3iD2B3B4”, ,3iB2B3D4” és ,3iB2D3B4” interferon, különösen hatékony induktorai humán sejtekben a 2-5 A szintetáz aktivitásnak. Azaz a ,3iD2D3D4”, ,3iD2B3B4”, ,34B2B3D4” és ,3iB2D3B4” hibrid interferonokból 108 egység/ml 17,5,11,4,8,5, illetve 9,6-szorosára növeli a 2-5 A szintetáz aktivitását Daudi sejtekben, összehasonlítva az eredeti a-2 és a-3 interferonnal és a referens ,3iB2D3D4” és ,JD1D2B3B4” interferonnal, amelyek 5,6,3,9,4,0, illetve 4,3-szoros aktivitásnövekedést eredményeznek. A találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok ezenfelül antiproliferativ aktivitást fejtenek ki. Az antiproliferativ aktivitást a következőképpen lehet meghatározni: az interferon tartalmú oldatokat ml-enként 5-104 Daudi sejttel inkubáljuk, 2 ml 10% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI táptalajban. A sejtszaporodást 3 napos inkubáció után határozzuk meg úgy, hogy az élő sejteket haemocytométerben megszámoljuk Trypan kék kizárásos teszt segítségével. A Daudi sejtek szaporodásának 50%-os gátlásához a ,3iD2D3D4”, ,3iD2B3B4”, ,31B2B3D4 , ,3jB2D3B4 , ,31D2B3D4 es ,3jD2D3B4” hibrid interferonokból körülbelül 4, 4, 1,3,1,3 4, illetve 4 egység/ml szükséges, azaz megközelítően azonos mennyiség, mint az eredeti a-2 interferonból és a ,31621)304” referens interferonból (1,3 egység/ml), de felülmúlják az eredeti a-3 interferont (körülbelül 20 egység/ml) és a ,J)1D2B3B4” referens hibrid interferont is (körülbelül 400 egység/ml). A humán ráksejtekkel szembeni antiproliferativ aktivitást szintén ki lehet mutatni in vivo. E célra különböző humán eredetű rákbetegséget - ilyen a mell-, vastagbélés tüdőrák, méhrák és melanoma - fejlesztünk ki csupasz egérben. A kifejlődött tumorokból kis darabkákat izolálunk és ezeket trokárral átültetjük egerekbe (Balh/c x DBA/2)F1 (CDFj) a vese-tok alá. Az IFN-t intramuszkulárisan adjuk be. 5-10s-5-107 NE/kg-ot tartalmazó injekciókban naponta kétszer, 1 -5 napon át. (NE - nemzetközi egység). A 6. napon az állatokat elöljük, a tumor végső nagyságát megmérjük és összehasonlítjuk a tumor kezdeti (az IFN-kezelés előtti) nagyságával és a kezeletlen kontroll egerek tumorának nagyságával. A találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonokkal, például a és ,3iB2D3B4” interferonnal való kezelés jelentősen és szignifikánsan gátolta a tumorok növekedését és részben a tumorok regresszióját is megfigyelhettük. Meglepő, hogy a hibrid interferonok antiproliferatív aktivitása felülmúlja az a-2 és a-3 kiindukási inter5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
