203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 Taql-gyel (pJC334 és pAM90) vagy Taql-gyel és Eco RI-gyel (pJC337) emésztjük és a 3’ hiányos végeket a megfelelő dezoxinukleotidokkal töltjük be, mint fent. A körülbelül 560 bp hosszú DNS-fragmentumokat agaróz gél eletktroforézissel és elektroelucióval -Micro Collodion zsákokat használva, mint fent - izoláljuk. Az előállított p31RT(A72) plazmid vektor részének 200 ng-ját és az eluált DNS-fragmentumok 200 ng-ját T4 DNS-ligáz segítségével összekapcsoljuk (A „vektor rész” azt a nagy DNS-fragmentumot jelenti, amely egy jóval kisebb mellett a p31RT(A72) plazmid EcoRI és Xhol (lásd fent) enzimekkel végzett restrikciós hasítása során keletkezik Ez a vektor DNS-molekula az ampillicin rezisztencia génje és egy replikációs origó mellett tartalmazza a PH05 promotert és a PH05 terminátort A vektor rész a klónozandó DNS-sel együtt (ez jelen esetben egy kb. 560 bázispár hosszúságú DNS-fragmentum, amely hibrid interferont kódol és a fent leírt módon, restrikciós emésztéssel állítható elő pJC334, pAM90 vagy pJC337 plazmáiból) alkotja a rekombináns DNS- molekulát (p31R/IFN AM104, p31R/IFN AMI 19, p31R/EFN AM 114), amely egy megfelelő gazdasejtben, pl. E. coli HB101-ben szaporítható). Az ampillicin rezisztenssé transzformált E. coli HB101 sejtekben tehát a következő plazmidok keletkeznek p31R/DFN AM 104 (a „6)626304” hibrid interferont kódoló szekvenciát tartalmazza), p31R/IFN AMI 19 (a „B1D2B3B4” hibrid interferont kódoló szekvenciát tartalmazza), illetve a p31R/IFN AMI 14 (a „DjD2B3D4” hibrid interferont kódoló szekvenciát tartalmazza). Ha ezeket a plazmidokat BamHI-gyel és HindHI-mal hasítjuk, egy körülbelül 1300 bp hosszú, -PH05 promoter - EFN protein kódoló szekvencia - PH05 transzkripció terminátor szignál - konfigurációjú DNS-fragmentumot kapunk, amelyet agaróz gél eletktroforézissel és elektroelucióval izolálunk Ezt a fragmentumot beklónozzuk a pJDB207 plazmid Hindin és BamHI helye közé. Ezzel a plazmiddal transzformáljuk a GRF18 élesztő törzset Leu+ tulajdonságra szelektálva (lásd a 100561 számú európai szabadalmi bejelentést és a 14. példát). A létrejött kiónok a következők S.cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM 104, GRF18/pJDB207 PH05/IFN AMI 14 és GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM 119. 8 * * * * 8. példa A pJDB207 PH05/IFN AMI 29 plazmid szerkesztése A pAM94 plazmidot (5. példa) teljesen elhasítjuk Taql-gyel és részlegesen (10 (ig/ml etidium-bromid jelenlétében) EcoRI-gyel. A részleges hasítás körülményei: puffer az enzimet előállító cég javaslata szerint; 0,75 egység EcoRI/pg DNS; inkubációs idő: 40 perc, 37 °C. Egy 580 bp hosszú DNS-fragmentumot izolálunk agaróz gél eletktroforézissel és elektroelucióval és hozzá kapcsoljuk a p31 RT(A72) plazmid EcoRI-gyei és Xhol-gyel hasított, gélben tisztított vektor részéhez (vö. a 6. példával). Az ampicillin rezisztens, transzformált E. coli HB101 sejtekből izoláljuk a p31R PH05/IFN AM 129 plazmidot. A plazmidot, amely a „B)D2D3D4” interferon kódoló szakaszát tartalmazza, HindM-mal és BamHI-gyel emésztjük és az 1300 bp hosszú DNS-fragmentumot bekapcsoljuk a pJDB207 plazmidba, a 7. példában leírtak szerint. A plazmiddal a GRF 18 élesztő törzset transzformáljuk, mint fent. A keletkező klón neve S.cerevisiae GRF 18/pJDB207 PH05/IFN AM 129 lesz. 9. példa A pJDB207 PH05/IFN AMI 06, AM 110 és AMI 12 plazmidok szerkesztése A pJDB207 PH05/IFN AM 104, AM 114 és AM 129 plazmidot (lásd a 7. és 8. példát) BamHI-gyel és PvuII- vel emésztjük és a 6,8 Kb hosszú vektorrészeket, amelyek az interferon kódoló régiók megfelelő C-terminális végeit tartalmazzák, agaróz gél eletktroforézissel és elektroelucióval izoláljuk. Hasonlóan a pJDB207/a- 2A72 (100561 számú európai szabadalmi bejelentés) plazmidot is emésztjük BamHI-el és PvuII-vel és a 800 bp hosszú DNS-fragmentumot izoláljuk. A megfelelő fragmentumok összekapcsolása - ligázzal - után E. coli HB101 sejteket transzformálunk, s így létrejönnak a következő plazmidok pJDB207 PH05/IFN AM 106 (a ,3jB2B3D4” hibrid interferont kódoló szakaszt tartalmazza) és AMI 12 (a ,3iB2D3B4” hibrid interferont kódoló szakaszt tartalmazza) és AMI 10 (a ,3iB2D3D4” hibrid interferont kódoló régiót tartalmazza). A GRF 18 élesztő törzset a szokásos módon transzformáljuk. A kapott kiónok elnevezése a következő: S.cerevisiae GRF 18 pJDB207 PH05/IFN AM 106, pJDB207 PH05/1FN AMI 12 és pJDB207 PH05/IFN AM 110. 10. példa A pJDB207 PH05/IFN DM1 és DM2 plazmidok szerkesztése A pJDB207 PH05/IFN AMI 19 plazmidot (7. példa) Hindül-al és Bglü-vel emésztjük és az interferont kódoló régió N -terminális végét tartalmazó 7,5 Kb vektor részt agaróz gél eletktroforézis és elektroelució segítségével izoláljuk Hasonlóan a pJDB207 PH05/IFN AMI 14 és pJDB207 PH05/EFN AM104 plazmidot (lásd a 7. példát) is ugyanezen enzimekkel emésztjük és az interferont kódoló régió C-tenninális végét tartalmazó körülbelül 600 bp hosszú DNS-fragmentumot izoláljuk A megfelelő fragmentumokat T4 DNS-ligáz segítségével összekapcsoljuk Az E. coli HB101 sejtek transzformálása után kapjuk a pJDB207 PH05/IFN DM1 plazmidot, amely a ,3)D2B3D4” hibrid interferont kódoló szakaszt tartalmazza és a pJDB207 PH05/TFN DM2 plazmidot, amely a „B)D2D3B4” hibrid interferont kódoló régiót tartalmazza. A GRF18 élesztő törzset a fent leírtak szerint transzformáljuk A kapott kiónokat a következőképpen neveztük el. S.cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM1 és S.cerevisiae GRF 18 pJDB207 PH05/IFN DM2. 11. példa A pJDB207 PH05/IFN HRÍ43 plazmid szerkesztése 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18
