203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 fragmentumot (körülbelül 4 Kb, illetve 521 bp hosszú) szacharóz gradiens centrifugálással választjuk el egymástól és a nagy fragmentumot defoszforiláljuk úgy, hogy 1 |xg DNS-fragmentumokat kezelünk 30 percig 37 °C-on 50 pJ 50 mmólos Tris-ben (pH= 8) borjúbél alkalikus foszfatázzal, 10pmól5’végre 1 egységet számítva, A „B1B2D3D4" és„DjD2B3B4” hibrid IFN-géneket úgy szerkesztjük, hogy összekapcsoljuk a fent leírt megfelelő nagy és kis DNS-fragmentumokat [a pAM2-ből származó nagy Hindlü-PvuII fragmentum (~4 Kb) és a pAM21-ből származó kis HindíII-PvuII fragmentum (521 bp) összekapcsolása eredményeként keletkezik a ,3iB2D3D4” típusú IFN, stb.]. Az összekapcsolást ligáz segítségével végezzük, úgy, hogy 10 pl 20 mmól triszüCl (pH=7,8) 10 mmól MgCl2,10 mmól DTT, 0,5 mmól rATP, 40 E/pl T4 DNS-ligáz (Biolabs) tartalmú oldatban körülbelül 500 ng nagy DNS-fragmentumot és 20-40 ng kis DNS-fragmentumot hozunk össze. Az elegyet 5 órán át 15 °C-on tartjuk, majd a ligázos keverék 5 pl-ével transzformálunk E. coli HB101 sejteket, mint fent, s így mintegy 1000 transzformáit telephez jutunk. Három telepet kiszúrtunk, izoláltuk a plazmid DNS-t és Hindin, PvuII, EcoRI, Taql és PstI enzimmel analizáltunk Két olyan telepet szelektáltunk, amelyek a megfelelő szerkezetű plazmid DNS-t [pAM27 (,31B2D3D4”) és pAM33 („D^B^”)] tartalmazták. 4. példa Hibrid IFN-gének szerkesztése a 150. aminosavnál megvalósított cross-overrel A pAM2 (a-3) és a pAM21 (a-2) plazmidokat Pvu- El-vel és Pstl-gyel emésztjük. A DNS-fragmentumokat szacharóz gradiens centrifugálással választjuk szét a PvuH-Pstl nagy fragmentumra (körülbelül 4 Kb, az a- 2 és a-3 IFN N-terminális 92 aminosavát kódolja) és a PvuH-Pstl kis fragmentumra (386, illetve 495 bp hosszúak, az a-2 és a-3 IFN C-terminálisait kódolják). A második lépésben, a pAM2-ből és a pAM21-ből származó tisztított PvuH-Pstl kis fragmentumot 32P- vel jelezzük a következőképpen: A DNS-fragmentumokat (~1 pg) 50 pj 50 mM-os trisz.HCl-ben (pH= 8,0) oldjuk és defoszforilzáljuk alkalikus foszfatázzal úgy, hogy 10 pmól 5’ végre 1 egység enzimet adunk, a kezelést 30 percig 37 °C-on végezzük Az enzimet 1 órás 65 °C-on való inkubálással inaktiváljuk és a DNS-t úgy tisztítjuk, hogy DEAE cellulózra adszorbeáljuk, majd eluáljuk, s az eluátumot etanoüal kicsapjuk A tisztítás körülményei: a felvitelhez használt puffer 50 mM trisz.HCl (pH=8,0) 0,15 M NaQ, 1 mM ETA; az eluáló puffer ugyanüyen összetételű. A DNS-t 20 pl reakcióelegyben foszforizáljuk, amely 50 mM triszJICl-t (pH= 9,5) 10 mMMgCl2-t, 5 mM DTT-t, 30-40 pj-nyi Uofilizált y-(32P)-ATP-t (Amersham, 6000 Ci/ mM; 1 mCi/ml) és 0,5 El pj T4 kínázt (P-L Biochemicals) tartalmaz. Az elegyet 20 percig 37 °C-on tartjuk, majd a reakciót 10 mM EDTA hozzáadásával állítjuk le. Ezután a megfelelő kezeletlen DNS-t (-4 pg) feleslegben adjuk a reakcióelegyhez, majd az oldatot fenollal és kloroformmal extraháljuk A DNS-t a maradék y-(32P)ATP-től kromatográfiásan választjuk el, Sephadex G50-nel TNE-ben. A Cserenkov-számlálással megállapított csúcs-frakciókat egyesítjük és etanoüal kicsapjuk A 32P-vel jelzett PvuH-Pstl-fragmentumokat teljesen megamésztjük Sau3A-val, a hasított DNS-t elektroforézissel választjuk el 6%-os poliakrüamid gélben és TBE futtató puffer használatával. A gélből négy DNS-fragmentumot izoláltunk; a PvuH-Sau3A-nak megfelelő két 172 bp hosszú fragmentumot (az IFNa- 2 és IFNa-3 93-150 aminosavát kódolják) és a Sau3A-PstI-nek megfelelő 214 bp, illetve 323 bp hosszú fragmentumokat (az IFN-a-2 és IFN-a-3 151 — 166 aminosavait kódolják). Három megfelelő fragmentum összekapcsolása után (lásd a 2. táblázatot) 4 olyan hibrid IFN-típus keletkezett, amelyekben a 150. aminosavnál történt a crossover. A megfelelő plazmidokat lépések sorozatán keresztül szerkesztjük meg: egy első ligáz reakcióban a PvuH-Sau3A és Sau3A-PstI DNS-fragmentumok ekvimoláris mennyiségeit kapcsoljuk össze 10 pl ligációs puff erben, amely 20 mM triszHCl-t (pH=7,8), 10 mM MgCl2-t, 10 mM DTT-t, 0,5 mM rATP-t és 40 E/pJ T4 DNS-ligázt tartalmaz. A reagáltatást 15°C-on 3-6 órán át végezzük s az eredmény a konkatamer DNS. ADNS- tPvuII-Pstl-gyel emésztjük, fenol/kloroform(l: 1) elegyével extraháljuk és a megfelelő PvuH-Pstl nagy fragmentumából [defoszforilálva: 1 pg DNS-t (körülbelül 0,6 pmól 5’vég/50 pl, 50 mM-os triszJICl-ben) (pH=8) 0,06 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal kezelünk 30 percig 37 °C-onJ feleslegben adunk hozzá, majd a DNS- t újra összekapcsoljuk ligázzaL E. coli HB101 sejteket transzformálunk a DNS-el és restrikciós analízissel (PvuII, Sau3A, Taql és EcoRI) határozzuk meg a kívánt szerkezetű DNS-t hordozó kiónokat. Ezek közül négyet kiemeltünk és a következőképpen neveztük el: E. coli HB101, pJC334, pJC337, pJC342 és pJC344 (lásd a következő oldalon a 2. táblázatot). 5. példa A 60. aminosavnál cross-overes hibrid IFN-ek szerkesztése Ezeknek a hibrid IFN-géneknek a szerkesztése lényegében ugyanolyan eljárással történik, ahogyan azt a 4. példában leírtuk. A pAM2 (a-3) és a pAM21 (a-2) plazmidot Hindl- H-al és PvuH-val hasítjuk, s a keletkező fragmentumokat szacharóz gradiens centrifugálással választjuk el. a Hindin-PvuH kis/ragmentumokat (521 bp; a ß-lac promoter régiót és az a-2 és a-3 IFN-ek N-terminális 92 aminosavát kódolják) 32P-vel jelezzük és részlegesen emésztjük Sau3A-val (0,5 egység enzim/pg DNS; 5 perc, 37 °C; a reakció megáüítása fenolos extrakcióval). A kapott keverékben lévő fragmentumokat elektroforézissel - 6%-os poliakrüamid gél - választjuk el. A gélből négy fragmentumot (két 424 bp HindHISau3A fragmentumot és két 97 bp Sau3A-PvuH fragmentumot) vonunk ki. A három megfelelő fragmentu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
