203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 test által megkötött IFNa-t megfelelő vizes oldatokkal eluáljuk, például körülbelül 2-5 pH-érték közti puffer-oldatokkal - ilyen a glicerin-puffer, vagy citromsavval vagy különböző összetételű pH gradienssel vagy sóoldatokkal, például tömény ammónium-szulfo-cianid-oldattal. Az IFNa-t tartalmazó eluátumot esetenként neutralizáljuk és innen izoláljuk ismert eljárások szerint a tisztított IFNa-t. A következő példák a jelen találmány magyarázatául szolgálnak, anélkül, hogy a találmány oltalmi körét e példákra korlátoznánk. A kísérleti részben említett mikroorganizmusok és vektorok ezért csupán példaként szolgálnak az eljárás megvalósításának szemléltetéséhez, és tetszőleges más, a heterológ expresszió szempontjából alkalmasnak tekinthető mikroorganizmusokkal, illetve vektorokkal helyettesíthetők. Ez utóbbiak a szakember számára jól ismertek, a letétbe helyezési intézetektől beszerezhetők, illetve a kereskedelemben hozzáférhetők. E témakörben idézzük a „Goning Vectors. A Laboratory Manual” c. kézikönyvet (P. H. Pouwels et al., Elsevier, Amsterdam, 1985) is. A szakember számára a leírásban idézett eljárásmódok és azok részletei ismeretesek, pl. az enzimes átalakításokat (pl. a restrikciós enzimekkel végzett hasítást) a szakember lényegében azon reakciókörülmények között végzi, amelyeket az adott enzim gyártója vagy a forgalmazó katalógusaiban ajánl, vagy amelyek a szakirodalomból, pl. Maniatis kézikönyvéből (T. Mania tis et. al.: Molecular Honing. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, 1982) megismerhetők. KÍSÉRLETI RÉSZ A példákban használt egyes rövidítések, illetve kifejezések: DTT l,4ditiotreitol TNE 50 mmól trisz. HG (pH=7,5), 100 mmól NaQ és 2 mmól EDTA tartalmú oldat Tris trisz-(hidroximetü)-aminometán EDTA etüén-diamin-tetraecetsav TE 10 mmól Tris és 50 mmól EDTA tartalmú oldat N-táptalaj összetétele literenként: 10 g Bacto-Trypton (Difco) 1 g élesztőkivonat (Difco) 1 glükóz 8gNaG 249 mg CaG2.2H20 TBE 89 mmól Tris, 89 mmól bórsav és 2 mmól EDTA tartalmú oldat BSA marhaszérum albumin HAT hipoxantin/aminopterin/timidin lg immunglobulin NE nemzetközi egység (interferonaktivitás) Az „rATP” rövidítés a ribóz-ATP kémiaüag pontos megnevezése (szemben a dATP rövidítéssel, amely dezoxiribóz jelenlétére utal) Mab monoklonális antitest (monoclonal antibody) PBS foszfáttal pufferolt konyhasóoldat SDS-PAGE nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél eletktroforézis „az érdeklődésre számot tartó frakciók” olyan frakciók, amelyek beépített linkerrel rendelkező radioaktív pBR322-t tartalmaznak az „ismételt kicsapás” ugyanolyan körülmények között történik, mint az adott példában egy előbbi helyen ismertetett első kicsapás a táptalajok összetétele - a fentieken túlmenően - az E. coli, illetve az élesztők tenyésztésével foglalkozó szakember számára ismert. Pl. az „M9” táptalajt Maniatis előbbiekben említett könyve a 440. oldalon részletezi; az „YNB” táptalaj a Difco Láb. cégtől szerezhető be stb. a „baktériumok (sejtek) elkülönítését” centrifugálással végezzük (1. az előbbiekben említett „Molecular Goning. A Laboratory Manual” c. kézikönyvet) a megadott rotor-típus (a rotor sugara), percenkénti fordulatszám és műveleti idő alapján a megfelelő „g” érték az ismert képlet segítségével számítható ki a „megfelelő kezeletlen DNS-fragmentum” olyan fragmentumot jelent, amely szekvencia tekintetében megegyezik a 32P-vel jelölttel, de nem jelzett. I. rész ct-2/ar3 interferon hibridek szerkesztése és klónozásuk Escherichia coliba Minden alább leírt hibrid interferon-protein kódoló szekvenciát mesterségesen hozzákötünk ß-laktamäz promoterhez, majd beklónozzuk a pBR322-ből származó expressziós plazmidba, amellyel E. coli HB101 törzset transzformálunk. 1. példa Limfloblasztoid IFNa.-2 és a-3 DNS-szekvenciát hordozó PvuII rezisztens vektorok szerkesztése A pBR322 plazmidot Pvuü-vel (Biolabs) hasítjuk és a lineáris DNS-t egy (32P)-BclI linkerhez [d(ATGTGTGATCACACAT) kapcsoljuk, amelyet szilárd fázisú foszfodiészter módszerrel szintetizáltunk (lásd: H. Rink és munkatársai, Nucleic Acids Research, 12, 6369 (1984) a következőképpen: A hasított plazmid DNS-t (1 |xg, körülbelül 0,7 pmól) hozzákapcsoljuk 32P-vel jelzett Bell linker DNS-hez (körülbelül 40 pmól) 50 pj reakcióelegyben, melynek összetétele a következő: 20 mM triszJIQ (pH= 7,8), 10 mM MgG2,10 mM DTT, 0,5 mM rATP és 40 El pj T4 DNS-ligáz (Biolabs). Az elegyet 2-3 órán át 15 °C-on inkubáljuk, ezután a vizes fázist azonos térfogatú fenol/kloroform elegyével extraháljuk, majd a DNS-t 1/9 térfogatnyi 10 x TNE és 2,5-szeres térfogatnyi etanol hozzáadásával kicsapjuk és -20 °C-on tartjuk egy éjszakán át. A DNS-üledéket 50 pj TE oldatban (pH= 8,0) reszuszpendáljuk, s ezt 5-23% szacharóz gradiensben [50 mM triszÜG (pH= 8,0), 1 mM EDTA], Kontron TST 60 rotorban centrifugáljuk 4 órán át 58000 ford/perc mellett, 15 °C-on. A gradienst felülről lefelé 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
