203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 Az egyik eljárás proteinek és más pcptidek szolubilizálására koleszterin-hemiszukcinát-trisz alkalmazásával, abból áll, hogy először vizes pufferban multilamelláris liposzómát készítünk Az így kapott multilamelláris liposzómák használhatók úgy, ahogy vannak; vagy ultrahanggal kezelve belőlük kis unilamelláris liposzómákat állítunk elő. A peptidet a vizes puffer-liposzóma keverékben szuszpendáljuk, a peptid a liposzómás kettős rétegekbe eloszlik és ezáltal szolubilizálódik Úgy is eljárhatunk, hogy a szolubilizált peptidet alkalmazzuk mint vizes fázist kis plurilamellás liposzómák (SPLVs) előállításához. Az ily módon előállított szolubilizált peptidkészítmény beadható emlősöknek, beleértve az embereket. A növekedési hormonokat használhatjuk a tejhozam növelésére vagy a kezdeti növekedés fokozására. Ha marha növekedési hormont adunk be intramuszkulárisan tejelő teheneknek a tejhozam növelésére, akkor általában naponta 10 mg szükséges. A találmányszerinti készítmény 30 napos, késleltetve felszabaduló dózisformájához körülbelül 300-1200 mg-ot adunk be egyetlen dózisban. A peptidek késleltetve felszabaduló dózisformáihoz szükséges beadandó mennyiséget szükség szerint az állatorvos vagy orvos állapítja meg. A tényleges dózist a dózisforma felszabadulási tulajdonságai, a szervezet által hasznosítható peptid mennyisége, toxikológiai megfontolások és hasonló tényezők határozzák meg. A találmány szerinti eljárást és készítményeket a példákkal szemléltetjük anélkül, hogy a találmány oltalmi körét ezekre korlátoznánk 1. példa Vízoldható vegyületeket beépítő koleszterin-hemiszukcinát -liposzómák A következő fejezetekben ismertetjük a koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák készítését, amelyekbe arzenazo Dl, inulin vagy króm vagy beépítve. Megállapítjuk a beépülés hatásfokára és a bezárt térfogatra vonatkozó paramétereket és demonstráljuk a koleszterin-liposzómák kalcium okozta instabüitását. Ismertetjük továbbá a koleszterin-hemiszukcinát liposzómák fagyasztott metszeteinek elektronmikroszkópos vizsgálatait, a röntgendiffrakciós és elektron spin rezonancia vizsgálatokat. 1.1 Liposzómák készítése, a koleszterin-hemiszukcinát különböző sóformáit használva Az alábbi fejezetekben ismertetjük a koleszterinhemiszukcinát-liposzómák előállítását, a koleszterinhemiszukcinát különböző sóformáit használva. Valamennyi példában, amelyben a koleszterin-hemiszukcinát trisz-sóformáját használjuk, a CHS- trisz sót a Sigma Biochemicals, St. Louis, MO. cégtől vásároltuk és tisztítás nélkül használtuk vagy a következőképpen szintetizáljuk; 30 ml 3,3 mólos triszbázis-oldatot adunk 1,5 liter 67 mólos éteres koleszterin-hidrogénszukcinát-oldathoz (ICN, Cleveland, Ohio). Az így kapott oldatot rotációs bepárolóban nedves maradékká bepároljuk és 12 órán át liofüizáljuk. Az üy módon előállított CHS-trisz sót etil-acetátból háromszor átkristályosítjuk. A visszamaradó etü-acetátot 56 °C-ra melegítve vákuumban (0,133 mbar) eltávolítjuk. 1.1.1. Koleszterin-hemiszukcinát-trisz-multilamelláris liposzómák 54 mg koleszterin-hemiszukcinát-trisz sót adunk 1 ml arzenazo ID-oldathoz (végső koncentráció 4,5 mM) 0,01 M trisz-HCl (pH-7,3), 0,14 M NaCl pufferban. Koleszterin-hemiszukcinát-multüamelláris liposzómák tejszerű szuszpenzióját képezzük mechanikai rázással. A fenti multilamelláris liposzómákat 15 percig centrifugálva (10 000 xg) gömböcskékké alakítjuk, és az így kapott gömböket 10 ml, 0,01 M trisz-HCl (pH =7,3), 0,14 M NaCl oldattal háromszor mossuk. Az így kapott termék vörös színű, ez jelzi az arzenazo Dl beépülését. 1.1.2. Koleszterin-hemiszukcinát 2-amino-2-metil-1,3-propán-diol-mul til amel l ár isi iposzómák 50 mg koleszterin-hemiszukcinát-2-amino-2-metil-l,3-propándiol sót adunk 1 ml arzenazo Dl-oldathoz (a végső koncentráció 4,5 mM), 0,01M 2-amino- 2-metil-l,3-propándiol-HCl (pH=7,3), 0,07 M KC1, 0,07 M NaCl pufferban. A koleszterin-hemiszukcinát-multüamelláris liposzómák szuszpenzióját üveggyöngyökkel végzett örvénylő keveréssel képezzük. A koleszterin-hemiszukcinát-multilamelláris liposzómákat 15 percig centrifugálva (10 000 x g) gömböcskékké alakítjuk, és az így kapott gömböcskéket az 1.1.1. fejezetben leírt módon háromszor mossuk. Az igy kapott termék vörös színű, ez jelzi az arzenano ID beépülését. 1.1.3. Koleszterin-hemiszukcinát-2-amino-etanolmultilamelláris liposzómák 50 mg koleszlerin-hemiszukcinát-2-amino-etanol sót adunk 1 ml arzenazo Dl oldathoz (a végső koncentráció 4,5 mM) 0,01 M 2-amino-etanol-HCl (pH=7,3), 0,07 M KC1, 0,07 M NaCl pufferban. A koleszterinhemiszukcinát-multilamelláris liposzómák szuszpenzióját üveggyöngyökkel végzett örvénylő keveréssel képezzük. A fenti liposzómákat 15 percig centrifugálva (10 000 x g) gömböcskékké alakítjuk, és az így kapott gömböket az 1.1.1. fejezetben leírtak szerint háromszor mossuk. A kapott gömbök vörös színűek, ez jelzi az arzenazo III beépülését. 1.1.4. Koleszterin-hemiszukcinát-bisz-trisz-propán-multilamelláris liposzómák 50 mg koleszterin-hemiszukcinát-bisz-trisz-propán sót adunk 1 ml arzenazo ID-oldathoz (a végső koncentráció 4,5 mM), 0,01 M bisz-trisz-propán-HQ (pH=7,3), 0,07 M KQ, 0,7 M NaCl pufferban. A koleszterin-hemiszukcinát-multüamelláris liposzómák szuszpenzióját üveggyöngyökkel végzett örvénylő keveréssel képezzük. A fenti liposzómákat 15 percig centrifugálva (10 000 x g) gömböcskékké alakítjuk, és az így kapott gömböket az 1.1.1. fejezetben leírt mó-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
