203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 szuszpenzióhoz és ezt szobahőmérsékleten éjszakán át állni hagyjuk. Ezután a keverékhez körülbelül 3 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 MNaCl puffert adunk, a teljes térfogatot 10 ml-re kiegészítve. Tojás foszfatidü-kolinból áűómultflameüárisüposzómákat (EPC-MLVs) (Avanti, Birmingham, AL) készítünk a következő előírás szerint: 40, 80, 160, 320 vagy 400 mg/ml EPC-t szuszpendálunk ellendő kloformban, hogy a foszfolipid tökéletesen feloldódjék. Az oldatot a kloformtól szárazra pároljuk, ekkor a kémcsőben viaszos anyag marad vissza. Ehhez adunk 2 ml, 0,01 Mtrisz-HQ (pH-7,3), 0,14 M Naapuffert 5 pl 3H-inulinnal (217,0 mCi/mg), a keveréket hagyjuk „duzzadni”, és az így kapott EPC-multilamelláris liposzómákat alapos örvénylő keveréssel diszpeigáljuk. Ezután még 3 ml 0,01 M HC1 (pH-7,3), 0,14 M NaQ puffert adunk a szuszpenzióhoz, amit éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyunk. Ekkor a keveréket 0,01M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaQ puffernd 10 ml teljes térfogatra kiegészítjük. A 3H-inulin beépülési hatásfokát a CHS- és EPC- multilamelláris liposzómákba a következőképpen határozzuk meg: a komponensek mindegyik kiindulási keverékének 20 pl aliquot részéből meghatározzuk a radioaktivitást szcintillációs számlálással, amint azt a fentiekben leírtuk. Előállításuk után a liposzómákat gömböcskékké alakítjuk, úgy, hogy a szuszpenziót 10- 20 percig centrifugáljuk (10 000 x g), a gömböcskéket négyszer mossuk 10 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14MNaCl puff erban és 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaQ pufferban 10 ml végső térfogatra kiegészítve újra szuszpendáljuk. Ennek a végső, mosott mintának 20 pl aliquot részéből meghatározzuk a radioaktivitást. A kezdeti radioaktivitásnak az a része, amit ebben a végső mintában mérünk, jelenti a lipid-liposzómákba beépült 3H-inulint. Amint azt az L táblázat szemlélteti, a beépülési hatásfok növekedése arányos a CHS-koncentrációval, de ami még fontosabb, a CHS-multüamelláris liposzómák, amelyek előállításához 20-200 mg/ml CHS-ot használtunk, az inulinra nagyobb beépülési hatásfokot mutatnak, mint az ugyanilyen koncentrációjú foszfolipid felhasználásával készült EPC-multilamelláris liposzómák. I. táblázat Inulin beépülési hatásfokának összehasonlítása foszfolipid-liposzómákba és koleszterin-hemiszukcinát-liposzómákba Lipidkon- 3H-Inulin beépülés centráció EPVMLVsa> CHS-MLVsb> (mg/ml) 20 2 10 40 4 14 80 5 29 160 8 38 200 11 60 a) tojás foszfatidü-kolin-multilamelláris liposzómák b) koleszterin-hemiszukcinát-multüamelláris liposzómák Abból a célból, hogy megállapítsuk, hogy a CHS- multilamelláris liposzómák beépülési hatásfokát befolyásolja-e az időtartam, a CHS-ot szabad 3H-inulinnal reagáltatjuk vizes pufferban. A CHS-multüamelláris liposzómákat a következőképpen állítjuk elő: 80 vagy 300 mg CHS-trisz sót 20 ml, 0,01 M trisz-HCl, 0,14 M NaQ pufferban, amely 10 p,l 3H-inulint (217 mCi/mg specifikus radioaktivitású) tartalmaz, örvénylő keveréssel keverünk, így CHS-multüamelláris liposzómákat képezünk 40, illetve 150 mg/ml CHS-koncentrációt használva. A két lipidkoncentráció mindegyikéből 5 mintát készítünk, és a CHS-multilameUáris liposzóma szuszpenziókat 2,0 ml, 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaCl pufferban szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 0, 15,30,60 és 120 perces időintervallumokban a mintákat a fenti pufferral 10 ml-re kiegészítjük. Egy kezdeti 10 pl aliquot részt veszünk mindegyik mintából szcintillációs számlálásra, ahogyan azt a fentiekben ismertettük. Ezután a mintákat 10 percig centrifugáljuk (10 000 x g) és a gömböcskéket 10 ml pufferban négyszer mossuk. A végén kapott gömböcskéket pufferban, 10 ml végső térfogatra szuszpendáljuk és mindegyik végső minta 10 pl aliquot részének radioaktivitását összehasonlítjuk a kezdeti minta radioaktivitásával minden egyes időpontban. Az eredmények nem mutatnak jelentős különbséget a beépülési hatásfokban az öt időpontban, a vizsgált lipid egyik koncentrációjára sem. Ez azt jelenti, hogy a készítményhez adott kezdeti 3H- inulinnak körülbelül 12%-a vagy 20%-a épül be, tekintet nélkül a 40 vagy 150 mg/ml CHS koncentrációjú minták reakcióidejére. Ez azt mutatja, hogy eltérően a hagyományos, tojás foszfatidU-kolint alkalmazó multüamelláris liposzómáktól, a CHS-multüamelláris liposzómáknál nincs szükség „duzzadási időre”-1.3. Inulin beépítése koleszterin-hemiszukcinátkis unilamelláris liposzómákba Mint beépített szert 3H-inulint tartalmazó, koleszterin-hemiszukcinátból álló kis unüameüáris liposzómákat áüítunk elő a következőképpen: 100 pl 3H-inulint (1,0 mCi/ml, New England, Nuclear, Boston, MA) feloldunk 2,5 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaQ pufferban, amelyhez 100 vagy 200 mg CHS-trisz sót adunk. A keveréket üveggyöngyökkel örvénylő keveréssel keverjük, majd a gyöngyökről pipettával leszívjuk és ultrahanggal kezeljük, amíg kitisztul, vagyis körülbelül 2 óra hosszat. A szuszpenzió kitisztulása jelzi, hogy a CHS-multüameüáris liposzómák kis unilamelláris liposzómákká alakultak át. A CHS végső koncentrációja a CHS-kis unüameüáris liposzóma szuszpenziókban 40 mg/ml, ületve 80 mg/ml. Az inulin beépülésének igazolása céljából a CHS- kis unüameüáris liposzómákat a be nem épült inulintól gélszűréssel elválasztjuk a következőképpen: mindegyik liposzóma-szuszpenziót külön Bio-Gel A-15 m, 100 mesh agaróz oszlopra (Bio-Rad Laboratories, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
